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β-氨基丙腈生物转化生产β-氨基丙酸的微生物菌种选育及其培养与转化工艺研究

作　者: 徐建妙
导　师: 郑裕国
学　校: 浙江工业大学
专　业: 生物化工
关键词: β-氨基丙酸筛选培养条件生物转化响应面
分类号: TQ922
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

β-氨基丙酸可以用来制备泛酸、泛酸钙和辅酶A等产品，是一种重要的医药原料和中间体。本研究的目的是开发一种微生物催化水解β-氨基丙腈生产β-产氨基丙酸的生物转化工艺，建立了β-氨基丙酸薄层层析扫描和反相液相色谱定量测定方法，选育到了能够产生腈水解酶并能转化生产β-产氨基丙酸的微生物菌种，并进行了鉴定。对β-氨基丙腈生物转化生产β-产氨基丙酸的菌种培养转化工艺进行了条件优化研究。从土样中筛选到4株具有转化β-氨基丙腈能力的微生物菌株。对其中一株菌株a39进行了生理生化检测和ATB系统(ID 32GN)鉴定，结果表明该菌为：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。菌株a39经低能离子注入诱变后，其催化水解β-氨基丙腈的比酶活提高了51.6％。建立了一种快速检测转化液中的β-氨基丙酸含量的方法：薄层层析扫描法和反相高效液相色谱方法。反相高效液相色谱方法以2，4-二硝基氟苯(DNFB)作为衍生化试剂，检测波长为360nm，样品平均回收率为99.3％，线性范围为：2μg／mL～1000μg／mL，其最低检测限为0.02ng。利用响应面法对发酵培养基组分进行了优化，试验结果表明最佳碳源和最佳氮源分别为蔗糖和酵母膏。当蔗糖、酵母膏、β-氨基丙腈的浓度分别为1.29％、0.71％和0.52％时，比酶活力达到22.51U／g。采用响应面法对嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)游离细胞转化条件进行了优化，当转化时间、底物浓度和菌体量分别为8h、2.5％和0.86g时，10mL转化液中的β-氨基丙酸产量为102.81mg。以静息细胞作为生物催化剂进行了酶特性的初步研究，结果表明：酶反应的最佳温度是35℃，最佳pH是8.4。对固定化细胞转化β-氨基丙腈进行了试验，结果表明：海藻酸钙固定化细胞的酶反应的最佳温度和底物浓度分别为40℃和1.5％，固定化细胞至少可以连续催化10批以上。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-31
  1.1 腈类物质  11
  1.2 产腈水解酶的微生物菌种以及植物  11-13
  1.3 腈水解酶的结构及其酶作用机制  13-16
  1.4 腈水解酶的工业应用  16-19
  1.5 β-氨基丙腈与β-氨基丙酸的性质与生产方法  19-22
  1.6 β-氨基丙酸的应用  22-24
  1.7 本课题的研究意义  24
  1.8 研究目标与思路  24-25
  1.9 参考文献  25-31
第二章 DNFB柱前衍生化HPLC检测转化液中β-氨基丙酸  31-44
  2.1 前言  31-32
  2.2 材料与方法  32-33
  2.3 结果  33-41
    2.3.1 不同的展开剂的配比对R_f值的影响  33-34
    2.3.2 薄层色谱线性及检测限  34
    2.3.3 衍生化物最大紫外吸收波长的确定  34-35
    2.3.4 流动相配方的选择  35-36
    2.3.5 衍生物的稳定性及保留时间  36-37
    2.3.6 衍生化试剂的浓度以及加量的确定  37-38
    2.3.7 线性关系及检测限  38-39
    2.3.8 精密度实验  39-40
    2.3.9 回收率实验  40-41
  2.4 本章小结  41-42
  2.5 参考文献  42-44
第三章水解β-氨基丙腈生产β-氨基丙酸的微生物菌种选育及鉴定  44-56
  3.1 前言  44
  3.2 材料与方法  44-47
  3.3 结果与讨论  47-54
    3.3.1 微生物筛选模型的建立  47-48
    3.3.2 菌落形态观察  48-49
    3.3.3 菌体形态观察  49-50
    3.3.4 菌株的ATB系统鉴定  50
    3.3.5 生理生化  50-52
    3.3.6 菌株a39的底物特异性研究  52
    3.3.7 微生物育种  52-54
  3.4 本章小结  54-55
  3.5 参考文献  55-56
第四章嗜麦芽寡养单胞菌(STENORTROPHOMONAS MALTOPHILIA)产酶培养条件优化  56-73
  4.1 前言  56-57
  4.2 材料与方法  57
  4.3 实验结果  57-72
    4.3.1 碳源选择  57-58
    4.3.2 氮源选择  58-59
    4.3.3 诱导剂的选择  59-60
    4.3.4 不同无机离子对菌体培养及产酶的影响  60-61
    4.3.5 碳源浓度优化  61
    4.3.6 氮源浓度优化  61-62
    4.3.7 底物诱导浓度的优化  62-63
    4.3.8 Pb~(2+)浓度对菌体生长以及产酶的影响  63-64
    4.3.9 培养基初始pH值对微生物产酶的影响  64-65
    4.3.10 接种量及培养时间对微生物产酶的影响  65
    4.3.11 培养基配方的优化  65-72
  4.4 本章小结  72
  4.5 参考文献  72-73
第五章 β-氨基丙酸微生物转化生产的转化条件研究  73-90
  5.1 前言  73
  5.2 材料与方法  73-74
  5.3 结果与讨论  74-88
    5.3.1 转化时间的初步确定  74-75
    5.3.2 不同浓度菌体对转化的影响  75-76
    5.3.3 底物的抑制作用  76
    5.3.4 不同的转化温度对转化的影响以及菌体的热稳定性  76-77
    5.3.5 最优转化体系以及最优转化pH值的确定  77-78
    5.3.6 转化条件优化  78-84
    5.3.7 固定化方法确定  84-85
    5.3.8 固定化颗粒中菌体比例的确定  85
    5.3.9 固定化颗粒量对转化的影响  85-86
    5.3.10 底物浓度对固定化细胞酶活的影响  86-87
    5.3.11 温度对固定化细胞酶活的影响  87-88
    5.3.12 固定化转化批次的确定  88
  5.4 本章小结  88-89
  5.5 参考文献  89-90
附录1 本文所用到的缓冲液配方  90-91
附录2 本文用到的统计学公式  91-92
攻读学位期间发表的论文  92-93
致谢  93

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