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三种生物恐怖因子重组优势抗原表位融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

作　者: 张士尧
导　师: 李娟
学　校: 吉林大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 生物恐怖因子布氏杆菌炭疽杆菌肉毒毒素原核表达亲和层析活性鉴定
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：生物恐怖活动由于对人群的普遍易感性、不可预见性以及强大的杀伤力，已日益引起世界各国的广泛关注。目前，全世界至少有15个国家和地区可能有生物战计划，主要集中在我国周边地区。因此，研制针对生物恐怖战剂的快速、灵敏、准确的检测试剂与方法十分必要。胶体金免疫层析法（GICA）具有快速、简便，且不需专门专业技术人员操作等优点，现已成为生物恐怖检测方法的研究热点；而胶体金免疫层析法的高灵敏度和特异度主要取决于抗原的设计和表达。方法：本研究选取三种常见的生物恐怖因子：布氏杆菌、炭疽杆菌和肉毒毒素作为研究对象，通过查询NCBI数据库和相关文献资料选取布氏杆菌、炭疽杆菌和肉毒毒素的B细胞优势抗原表位，加入酶切位点、His-tag标签以及linker，根据大肠杆菌密码子偏好基因进行优化，并转入pET-20b原核表达载体构建重组布氏杆菌外膜蛋白抗原表达载体（pET-20b-rOmp）、重组炭疽杆菌保护性抗原表达载体（pET-20b-rPA）、重组肉毒毒素重链抗原表达载体（pET-20b-rHc）。通过设置不同浓度的IPTG及诱导时间，确定三种蛋白的最优表达条件；经过超声破碎、尿素溶解并采用SDS-PAGE鉴定，鉴定其表达形式；采用镍离子亲和层析法对于目的蛋白进行纯化，并应用SDS-PAGE以及Western blot法进行鉴定，采用Western blot法鉴定三种融合蛋白的生物学活性。结果：成功构建了pET-20b-rOmp、pET-20b-rPA和pET-20b-rHc三种原核表达载体；三种蛋白的最优表达条件为IPTG浓度为1mM，诱导时间为4h；三种蛋白均为包涵体表达，纯化后三种蛋白均具有较高纯度，western blot法鉴定，三种蛋白分别能够与布氏杆菌单克隆抗体、炭疽沉淀素抗体和肉毒毒素诊断血清发生特异性反应，表明三种重组抗原在工程菌中获得正确表达，并具有良好的生物学活性。结论：本研究成功构建并表达了三种生物恐怖因子的优势抗原融合蛋白，具有良好的免疫学特性，为进一步研制三种生物恐怖因子胶体金免疫层析法同步快速检测试纸条奠定了基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
第1章绪论  10-20
  1.1 生物恐怖概述  10-11
    1.1.1 生物恐怖  10
    1.1.2 生物恐怖因子  10-11
  1.2 布氏杆菌研究进展  11-14
    1.2.1 布氏杆菌概述  11
    1.2.2 布氏杆菌外膜蛋白研究进展  11-13
    1.2.3 布氏杆菌检测方法研究进展  13-14
  1.3 炭疽杆菌研究进展  14-16
    1.3.1 炭疽杆菌概述  14
    1.3.2 炭疽杆菌抗原研究进展  14-15
    1.3.3 炭疽杆菌检测方法研究进展  15-16
  1.4 肉毒毒素研究进展  16-19
    1.4.1 肉毒毒素概述  16-17
    1.4.2 肉毒毒素的结构  17
    1.4.3 肉毒毒素检测方法研究进展  17-19
  1.5 论文研究目的与意义  19-20
第2章材料与方法  20-31
  2.1 实验材料与仪器  20-22
    2.1.1 主要材料  20
    2.1.2 主要仪器  20-21
    2.1.3 试剂配制  21-22
  2.2 实验方法  22-31
    2.2.1 布氏杆菌、炭疽杆菌和肉毒毒素主要优势抗原表位的选取  22-23
    2.2.2 重组布氏杆菌原核载体（pET-20b-rOmp）、重组炭疽杆菌原核表达载体（pET-20b-rPA）、重组肉毒毒素原核表达载体（pET-20b-rHc）的构建  23-25
    2.2.3 原核表达载体 pET-20b-rOmp、pET-20b-rPA 和pET-20b-rHc 的鉴定  25
    2.2.4 重组布氏杆菌主要优势抗原融合蛋白（rOmp）、炭疽杆菌主要优势抗原融合蛋白（rPA）和肉毒毒素主要优势抗原融合蛋白（rHc）的原核表达  25-28
    2.2.5 western blot 法鉴定重组融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的诱导表达  28-29
    2.2.6 重组融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的纯化  29-30
    2.2.7 Western blot 法鉴定纯化的重组融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的生物学活性  30-31
第3章实验结果  31-49
  3.1 布氏杆菌、炭疽杆菌和肉毒毒素主要优势抗原表位的选取  31-32
  3.2 原核表达载体 pET-20b-rOmp、pET-20b-rPA 和 pET-20b-rHc 的鉴定  32-38
  3.3 重组融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 最优表达条件的确定  38-41
  3.4 western blot 法鉴定重组融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的诱导表达  41-43
  3.5 重组融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 表达形式的确定  43-45
  3.6 重组融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc 的纯化  45-47
  3.7 Western blot 法鉴定纯化的重组融合蛋白 rOmp、rPA 和 rHc的生物学活性  47-49
第4章讨论  49-52
第5章结论  52-53
参考文献  53-60
作者简介  60-61
致谢  61

三种生物恐怖因子重组优势抗原表位融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

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