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福氏志贺氏菌可溶性蛋白复合物研究

作　者: 牛畅
导　师: 华跃进
学　校: 浙江大学
专　业: 生物物理学
关键词: 福氏志贺氏菌蛋白复合物 BN-PAGE LPS合成谷氨酸脱羧酶 ATP合成酶抗酸性
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

福氏志贺氏菌是最常见的引起细菌性痢疾的病原菌,它与大肠杆菌在基因组水平上有着高度的同源性和相似性,它们的区别主要在于毒力大质粒的有无。所以有观点认为,志贺氏菌是由大肠杆菌获得毒力大质粒进化而来的。同时,志贺氏菌也是一个质粒毒力基因和染色体各类基因协同进化、相互适应的典型范例。由于一个蛋白并不是独立地完成某个生物学功能,而是要与其他蛋白结合并相互调节形成蛋白复合物来行使其功能,因此仅对单个蛋白进行定性和功能分析已不能满足我们从整体水平深入了解志贺氏菌的需求。于是,我们实验室首次开展了对志贺氏菌全菌可溶性蛋白复合物的研究,用BN/SDS-PAGE2-D电泳的方法共分离并鉴定到福氏2a型志贺氏菌2457T中的53个同源多聚体蛋白复合物和9个异源多聚体蛋白复合物。在这些同源多聚体蛋白复合物中,50个是已在大肠杆菌中报道过的,还有3个是以前未被报道过的。通过进一步研究希望能够揭示细胞生理状态的本质、对外界环境刺激的反应途径以及细胞调控的机理。在本研究中,我们比较了在37℃和30℃培养条件下福氏志贺氏菌蛋白复合物的表达情况,发现在不同的培养温度下3个蛋白复合物(PyrB/PyrI、GlmS和MglB)表达丰度的改变与细菌脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)的合成有关。已有许多研究表明,LPS的合成对于福氏志贺氏菌毒力的发挥是必不可少的。同时,通过对比福氏志贺氏菌野生株与毒力大质粒缺失突变株以及大肠杆菌野生株与毒力大质粒导入突变株在蛋白复合物表达上的差异,我们发现福氏志贺氏菌毒力大质粒通过调控谷氨酸脱羧酶及ATP合成酶的表达,从而调节菌株的抗酸性。志贺氏菌作为肠道致病菌,要在胃酸和肠道内产生的不稳定的脂肪酸中生存,抗酸性是非常重要的表型,有研究认为强抗酸能力可能是志贺氏菌超低感染剂量的一个重要因素,而上述结果更为清晰地展示了志贺氏菌在进化过程中形成的独特的抗酸机制。综上所述,福氏志贺氏菌可溶性蛋白复合物表达谱的构建,扩展了对福氏志贺氏菌生理学特性的了解；不同培养温度下蛋白复合物表达变化的结果,为全面深入分析志贺氏菌致病的分子机制提供了极其重要的线索。此外目前已经明确,除了毒力大质粒上的核心毒力基因编码区外,许多染色体上的基因也参与了志贺氏菌的致病过程。因此,要更好地研究志贺氏菌的致病机理,还需要阐明毒力大质粒与致病菌基因组(染色体)之间的调控关系。本文构建缺失毒力大质粒突变株、大肠杆菌毒力大质粒导入突变株与野生株进行对比的研究设计开辟了筛选毒力相关蛋白的新思路；复合物研究中所采用的技术改进以及获得的宝贵经验也为深入开展蛋白质复合物研究奠定了坚实的基础。

全文目录

致谢  7-9
摘要  9-11
Abstract  11-13
主要缩略词  13-14
目次  14-17
1 文献综述  17-28
  1.1 志贺氏菌简介  17
  1.2 志贺氏菌的进化  17-19
  1.3 志贺氏菌致病途径  19-20
  1.4 志贺氏菌发病机理的分子决定因素  20-23
    1.4.1 毒力大质粒  20-21
    1.4.2 毒力大质粒基因表达调控  21-22
    1.4.3 Ⅲ型分泌系统  22-23
  1.5 志贺氏菌抗酸机制  23-24
  1.6 细菌脂多糖的功能  24
  1.7 BN-PAGE简介  24-26
  1.8 本研究的目的和意义  26-28
2 温度对福氏志贺氏菌2457T LPS合成的影响  28-51
  2.1 实验材料  29-32
    2.1.1 菌株  29
    2.1.2 主要化学试剂与耗材  29-30
    2.1.3 实验仪器与分析软件  30
    2.1.4 常用试剂配制  30-32
  2.2 实验方法  32-38
    2.2.1 细菌培养  32
    2.2.2 BN/SDS-PAGE 2-D电泳  32-35
    2.2.3 RNA的提取和Real-time PCR  35-37
    2.2.4 LPS的制备  37
    2.2.5 银染  37
    2.2.6 透射电子显微镜  37
    2.2.7 构建Myc标签的SodB蛋白  37-38
    2.2.8 Western blot分析  38
  2.3 实验结果  38-43
    2.3.1 不同培养温度下福氏志贺氏菌蛋白复合物差异表达分析  38-40
    2.3.2 差异表达蛋白的转录水平验证  40-41
    2.3.3 差异表达蛋白与细菌LPS合成的关系  41-42
    2.3.4 不同培养温度下LPS合成的量不一致  42-43
  2.4 讨论  43-51
    2.4.1 BN/SDS-PAGE 2-D电泳技术的局限性  43-45
    2.4.2 不同培养温度差异表达蛋白复合物分析  45-48
    2.4.3 Real-time PCR验证  48
    2.4.4 LPS的合成与温度相关  48-51
3 福氏志贺氏菌毒力大质粒与抗酸性的关系  51-83
  3.1 实验材料  52-53
    3.1.1 菌株和载体  52
    3.1.2 主要化学试剂与耗材  52
    3.1.3 实验仪器与分析软件  52
    3.1.4 主要试剂的配制  52-53
  3.2 实验方法  53-58
    3.2.1 IEF/SDS 2-D电泳  53
    3.2.2 301 R27质粒导入株的构建  53-56
    3.2.3 sfh基因导入株的构建  56-57
    3.2.4 磁珠捕获实验  57
    3.2.5 GadB表达载体的构建  57
    3.2.6 蛋白降解实验  57
    3.2.7 流式细胞术检测抗酸性  57-58
    3.2.8 菌株ATP含量检测  58
  3.3 实验结果  58-72
    3.3.1 毒力大质粒影响GadA/B的表达  58-60
    3.3.2 导入R27质粒GadA/B表达降低  60-61
    3.3.3 与GadA/B相互作用蛋白的分离与鉴定  61-63
    3.3.4 导入sfh基因GadA/B表达降低  63
    3.3.5 GadB的表达调控不是翻译后的蛋白降解  63-64
    3.3.6 GadA/B的表达调控在转录水平  64-65
    3.3.7 GadA/B的表达水平与菌株抗酸性相关  65-69
    3.3.8 毒力大质粒降低ATP合成酶复合物的表达  69
    3.3.9 菌株中ATP含量检测  69-70
    3.3.10 毒力大质粒不改变ATP合成酶AtpA和AtpD亚基的表达  70-71
    3.3.11 Western blot验证毒力大质粒不改变ATP合成酶AtpD亚基的表达  71-72
  3.4 讨论  72-83
    3.4.1 各菌株BN/SDS-PAGE 2-D电泳和IEF/SDS-PAGE 2-D电泳原图  72-77
    3.4.2 毒力大质粒与染色体协同进化  77-80
    3.4.3 细菌基因表达调控机制  80-81
    3.4.4 ATP合成酶BN/SDS PAGE和IEF/SDS PAGE 2-D电泳结果不一致的原因  81-83
结论  83-85
参考文献  85-95
作者简历  95

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