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固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究

作　者: 朱菲
导　师: 梅乐和
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 谷氨酸脱羧酶 γ-氨基丁酸 聚乙烯醇 海藻酸钠 固定化 包埋 Ni-NTA 金属螯合
分类号: Q814.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


Y-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,简称GABA)是哺乳动物神经系统的一种神经递质抑制剂,对人体具有镇静安神、促进睡眠、改善免疫功能等作用,在食品和医药领域具有广泛的应用价值,由生物方法制备的GABA已被我国卫生部列为“新资源食品”。生物体内的GABA由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,简称GAD)催化谷氨酸脱羧生成,因此GAD是GABA生物制备的关键酶。为了提高GABA生物制备方法的效率和竞争力,本文以利用固定化GAD进行GABA的生物制备为目标,分别采用凝胶包埋法和金属螯合方法进行了GAD的固定化,考察了固定化条件对固定化酶性能的影响,优化了固定化条件,测定了所得固定化酶的底物亲和强度、最适催化条件和操作稳定性等关键性质,为利用固定化GAD进行GABA的生物制备创造了条件。具体研究内容如下：对聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,简称PVA)-海藻酸钠(sodium alginate,简称SA)固定化GAD的条件进行了研究。分别考察了PVA浓度和SA浓度对凝胶颗粒直径、机械强度以及固定化后酶活力保留的影响；PVA和SA比例对固定化后酶活力保留的影响；PVA-SA与GAD酶液比例对固定化酶催化活力和酶活回收率的影响；以及CaCl2浓度对固定化后GAD酶活力的影响。研究表明,当PVA浓度为9%,SA浓度为2.5%,PVA:SA (W/W)为70：30,PVA-SA:GAD(W/V)为6：1,CaCl2浓度为1%时能获得机械强度好,酶活回收率最高的固定化GAD凝胶颗粒。在上述优化的条件下,考察了固定化GAD的各项酶学性质,并与游离酶加以比较。同时,测定了固定化后GAD的表观动力学参数,评估了PVA-SA包埋法固定化GAD的操作稳定性。研究表明,GAD的最适催化温度与游离酶相同为50℃；最适催化pH向碱性方向略有改变为pH4.8；热稳定性最强的温度为45℃,比游离酶高了10℃；酸碱稳定性最好的pH为5.2,在实验设定的pH范围内,固定化GAD的稳定性大大高于游离酶；Km为13.6 mmol/L;连续催化7次以后,固定化GAD酶活力仍然保持在初始值的87%左右,说明PVA-SA法制备的固定化GAD凝胶颗粒操作稳定性好,具有很好的应用前景。利用亲和层析介质Ni-NTA对GAD进行了固定化,并测定了固定化后的各项酶学性质,动力学参数,考察了其操作稳定性。Ni-NTA亲和固定化GAD的最佳投料浓度为0.6mg/mL;最适催化温度与游离酶相同为50℃；最适pH向碱性方向略有改变为pH4.8；酸碱稳定性最强的pH为5.6,热稳定性最好的温度为35℃；Km值为34.4mmol/L;重复使用8次后,活力保持初始活力的75%。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
目录  10-13
第一章 文献综述  13-31
  1.1 固定化酶技术  13-21
    1.1.1 固定化酶技术概述  13
    1.1.2 固定化酶方法  13-19
    1.1.3 固定化酶的性质  19-20
    1.1.4 评价固定化酶活性的指标  20-21
  1.2 PVA凝胶固定化生物催化剂  21-25
    1.2.1 PVA概述  21
    1.2.2 PVA凝胶固定化生物催化剂  21-23
    1.2.3 PVA-SA凝胶固定化生物催化剂  23-25
  1.3 γ-氨基丁酸  25-28
    1.3.1 GABA性质  25-26
    1.3.2 GABA生理功能  26-27
    1.3.3 GABA制备方法  27-28
    1.3.4 GABA的应用  28
  1.4 谷氨酸脱羧酶及其固定化研究现状  28-29
    1.4.1 谷氨酸脱羧酶的分布和生理功能  28-29
    1.4.2 GAD固定化研究现状  29
  1.5 本文主要内容及研究思路  29-31
第二章 PVA-SA凝胶包埋固定化谷氨酸脱羧酶的条件优化  31-49
  2.1 引言  31
  2.2 材料与方法  31-36
    2.2.1 实验材料  31-32
    2.2.2 实验仪器  32
    2.2.3 实验方法  32-36
  2.3 结果与讨论  36-47
    2.3.1 PVA-SA凝胶珠的外观结构  36-37
    2.3.2 PVA浓度对凝胶成球性的影响  37-38
    2.3.3 PVA、SA浓度对凝胶珠直径的影响  38-39
    2.3.4 PVA、SA浓度对凝胶珠机械强度的影响  39
    2.3.5 PVA浓度对固定化GAD酶活力的影响  39-41
    2.3.6 SA浓度对固定化GAD酶活力的影响  41-42
    2.3.7 PVA与SA比例对固定化GAD酶活力的影响  42-43
    2.3.8 PVA-SA与GAD比例对固定化GAD酶活力的影响  43-44
    2.3.9 PVA-SA与GAD比例对GAD酶活回收率的影响  44-45
    2.3.10 CaCl_2浓度对固定化GAD酶活力的影响  45-46
    2.3.11 PVA-SA凝胶珠膨胀率  46-47
  2.4 本章小结  47-49
第三章 PVA-SA凝胶固定化谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究  49-59
  3.1 引言  49
  3.2 材料与方法  49-50
    3.2.1 实验材料  49
    3.2.2 实验仪器  49-50
    3.2.3 实验方法  50
  3.3 结果与讨论  50-58
    3.3.1 固定化对GAD最适pH的影响  50-51
    3.3.2 固定化对GAD最适温度的影响  51-52
    3.3.3 固定化对GAD热稳定性的影响  52-53
    3.3.4 固定化对GAD pH稳定性的影响  53-54
    3.3.5 固定化对GAD与底物结合的影响  54-55
    3.3.6 固定化酶的重复使用稳定性  55-58
  3.4 本章小结  58-59
第四章 金属螯合固定化谷氨酸脱羧酶的研究  59-73
  4.1 引言  59
  4.2 材料与方法  59-62
    4.2.1 实验材料  59-60
    4.2.2 实验仪器  60
    4.2.3 实验方法  60-62
  4.3 结果与讨论  62-71
    4.3.1 Ni-NTA纯化法的酶活回收率  62-64
    4.3.2 GAD酶液浓度对于固定化的影响  64
    4.3.3 固定化对GAD最适pH的影响  64-65
    4.3.4 固定化对GAD最适温度的影响  65-66
    4.3.5 固定化对GAD pH稳定性的影响  66-67
    4.3.6 固定化对GAD热稳定性的影响  67-68
    4.3.7 固定化对GAD与底物结合的影响  68-69
    4.3.8 固定化酶的重复使用稳定性  69-70
    4.3.9 PVA-SA固定化GAD方法与Ni-NTA固定化GAD方法比较  70-71
  4.4 本章小结  71-73
第五章 结论与展望  73-75
  5.1 结论  73-74
  5.2 展望  74-75
参考文献  75-83
作者简介  83

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程 > 固定化酶和固定化细胞技术
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