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福氏2a志贺氏菌2457T的cobB，gtrⅡ和yciD基因功能的研究

作　者: 刘小青
导　师: 魏华；王恒樑
学　校: 南昌大学
专　业: 微生物学
关键词: 福氏志贺氏菌2a cobB GTRⅡ yciD 基因敲除蛋白质
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

志贺氏菌中糖基转移酶(Glucosyltransferases, Gtrs)和O-乙酰基转移酶是膜结合蛋白,共同决定着血清型的不同,在福氏2a志贺氏菌中,GtrⅡ为血清特异型,能将O-抗原重复单元上的鼠李糖Ⅲ糖基化,从而将福氏志贺氏菌2a区别于志贺氏菌Y型。在原核生物中,去乙酰化酶CobB控制乙酰辅酶A合成酶(Acetyl-coenzyme synthetases, Acs)的乙酰化,和真核生物中的Sir2(Silent information regulator 2)有很大的同源性，由此推定CobB可能和染色质的沉默有关。YciD为假想外膜蛋白,属于OmpW家族蛋白。志贺氏菌毒力的表达受到温度的控制,在37℃条件下,毒力蛋白表达,而30℃下毒力蛋白不表达,在福氏2a志贺氏菌2457T的30℃C和37℃的比较蛋白质组学研究中发现,yciD基因所编的外膜蛋白在37℃C表达上调,因此yciD基因可能为毒力相关基因。为研究这三个基因的功能,探讨是否为毒力相关基因,本文采用λ-Red重组系统成功构建了福氏2a志贺氏菌2457T的cobB, gtrⅡ缺失突变株,yciD突变株为前期构建好了的缺失突变株,分别命名为AcobB::kan,ΔgtrⅡ::kan,ΔyciD::kan。对这三个突变株和野生株进行豚鼠角膜实验,结果发现ΔcobB::kan,ΔgtrⅡ::kan引起的症状稍微比野生株症引起的要轻微些,ΔyciD::kan突变株的炎症反应最弱。为寻找毒力相关基因的差异表达蛋白,本文制备了野生株和这三个缺失突变株的全菌蛋白样品,进行双向电泳后比较野生株和缺失株的蛋白表达谱。结果发现,ΔcobB::kan,ΔgtrⅡ::kan缺失突变株与野生株并无明显差异,ΔyciD::kan则有一个蛋白表达明显下调。为进一步研究ΔyciD::kan,制备了它和野生株的外膜蛋白,双向电泳后,比较发现有三个蛋白点表达明显下调。毒力评价实验中,Hella细胞竞争侵袭指数为0.8,肺侵袭实验中竞争指数为0.9,因此,cobB,gtrⅡ可能不影响志贺氏菌的侵袭过程,而yciD的缺失能使其毒力减弱,然而对志贺氏菌的侵袭影响不大。为了探究志贺氏菌中有多少蛋白被磷酸化,本文通过Western blotting方法从全菌蛋白中发现了13个磷酸化蛋白。本文的研究结果拓宽了对志贺氏菌基因功能的认识,为研究翻译后修饰基因和外膜蛋白基因提供了方法学借鉴。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-10
第1章文献综述  10-22
  1.1 福氏志贺氏菌的致病过程  11-12
  1.2 福氏志贺氏菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)及其效应分子  12-14
  1.3 福氏志贺氏菌染色体上的毒力相关基因  14-17
  1.4 本实验的研究思路与目的  17-18
  1.5 参考文献  18-22
第2章福氏2a志贺氏菌2457T cobB,gtrⅡ #13突变体的构建及鉴定  22-36
  2.1 前言  22-23
  2.2 材料与方法  23-29
    2.2.1 菌株与质粒  23
    2.2.2 主要化学试剂与耗材  23
    2.2.3 主要仪器与分析软件  23-24
    2.2.4 引物设计  24-25
    2.2.5 PCR扩增条件  25
    2.2.6 线性打靶DNA的构建  25-26
    2.2.7 目的基因的缺失  26-28
      2.2.7.1 将含λ-Red重组系统的质粒导入福氏志贺氏菌2a 2457T野生株中  26-27
      2.2.7.2 线形打靶片段的电击转化  27-28
    2.2.8 cobB,gtrⅡ基因缺失突变体在分子水平上的验证  28
    2.2.9 突变株与野生株生长状态的测定  28-29
  2.3 结果  29-34
    2.3.1 长同源臂突变盒的构建  29-30
    2.3.2 cobB,gtrⅡ突变体的构建  30-31
    2.3.3 cobB,gtrⅡ突变体缺失及毒力验证  31-32
    2.3.4 突变株与野生株生长状态的测定  32-34
  2.4 讨论  34-35
    2.4.1 缺失突变株的构建  34-35
  2.5 参考文献  35-36
第3章福氏2a志贺氏菌cobB,gtrⅡ,yciD基因突变株与野生株蛋白表达谱的比较  36-52
  3.1 前言  36-37
  3.2 材料与方法  37-42
    3.2.1 菌株和培养条件  37
    3.2.2 主要化学试剂与耗材  37
    3.2.3 仪器与软件  37-38
    3.2.4 溶液配制  38
    3.2.5 全菌蛋白的样品制备  38-39
    3.2.6 △yciD∷kan外膜蛋白样品的制备  39
    3.2.7 双向电泳  39-41
    3.2.8 电泳凝胶的考马斯亮蓝染色(考染)与脱色  41-42
    3.2.9 图像扫描与分析  42
    3.2.10 蛋白差异点鉴定  42
  3.3 结果  42-50
    3.3.1 △cobB∷kan,△gtrⅡ∷kan,△yciD∷kan与野生株全菌蛋白双向电泳的图谱比较  42-47
    3.3.2 △yciD∷kan与野生株外膜蛋白双向电泳的图谱比较  47-49
    3.3.3 △yciD∷kan差异点蛋白的MALDI-TOF/TOF质谱鉴定  49-50
  3.4 分析与讨论  50-51
  3.5 参考文献  51-52
第4章福氏2a志贺氏菌cobB,gtrⅡ,yciD基因突变株与野生株毒力的相关性研究  52-64
  4.1 前言  52-53
  4.2 材料与溶液配制  53-55
    4.2.1 菌株与材料  53
    4.2.2 主要生化试剂与实验仪器  53-54
    4.2.3 溶液配制  54-55
      4.2.3.1 细胞培养溶液的配制  54
      4.2.3.2 培养基的配制  54
      4.2.3.3 麻醉剂的配制  54-55
  4.3 实验方法  55-57
    4.3.1 PCR毒力检测及缺失验证  55
    4.3.2 野生株和突变株豚鼠角膜实验(Sereny Test)的比较  55
    4.3.3 竞争性侵袭HeLa细胞实验  55-56
      4.3.3.1 HeLa细胞的培养  55-56
    4.3.3 HeLa细胞实验  56
    4.3.4 小鼠肺竞争性侵袭实验  56-57
  4.4 结果与分析  57-62
    4.4.1 PCR毒力检测及缺失缺失验证  57-58
    4.4.2 野生株和突变株豚鼠角膜实验(Sereny Test)的比较  58-60
    4.4.3 △yciD:kan的HeLa细胞侵袭实验  60
    4.4.4 △yciD:kan小鼠肺竞争性侵袭实验  60-62
  4.5 结果与分析  62-63
  4.6 参考文献  63-64
第5章福氏志贺氏菌磷酸化蛋白的检测  64-73
  5.1 前言  64-65
  5.2 材料与方法  65-66
    5.2.1 菌株  65
    5.2.2 主要化学试剂与耗材  65
    5.2.3 主要仪器、分析软件  65-66
    5.2.4 溶液的配置  66
  5.3 实验方法  66-68
    5.3.1 全菌蛋白磷酸化样品的制备  66-67
    5.3.2 双向电泳  67
    5.3.3 western blotting  67
    5.3.4 胶内酶切和MALDI-TOF/MS鉴定  67-68
  5.4 结果  68-71
    5.4.1 全菌蛋白磷酸化样品双向电泳和western blotting图  68-69
    5.4.2 质谱鉴定结果  69-71
  5.5 讨论  71-72
  5.6 参考文献  72-73
第6章结论与建议  73-75
蛋白负染方法在蛋白质组学中的应用评价  75-76
个人简历  76
攻读学位期间的研究成果  76-77
致谢  77-78

福氏2a志贺氏菌2457T的cobB，gtrⅡ和yciD基因功能的研究

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