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紫芝胞外多糖蛋白复合物的制备提纯与生物活性研究

作　者: 王丽
导　师: 韩宝芹
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生物工程
关键词: 紫芝多糖蛋白复合物发酵分离纯化抗肿瘤
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肿瘤是严重威胁人类生命的常见病和多发病之一,全世界每年有1000多万新病例和600多万人死亡,其死亡率列居第二,仅次于心血管疾病。目前的研究已经证实,灵芝多糖肽具有明显的抗新生血管形成活性,对肿瘤细胞的生长也有着一定的抑制作用,并且相对于多糖,有着口服有效性,在抗肿瘤研究的将来有着十分广阔的前景。紫芝与赤芝同属,是我国的特有种类,国内外对它的研究报道甚少。本研究项目在前期研究的基础之上,进一步完善灵芝抗肿瘤的研究。对紫芝菌株的深层发酵液配方进行了优化,通过单次单因素和正交实验,确定了其最佳深层液体发酵培养基组分为:(w/v):葡萄糖3.5%,蛋白胨0.3%,酵母粉0.1%,KH2PO4 0.1%, MgSO4 0.05%,维生素B1 0.005%;最适发酵培养条件为:28℃,160rpm/min,装液量150ml,培养14d后菌株生长状态最好,菌丝体产率可达6.7g/L。对发酵液上清进行脱除游离蛋白的处理,分别采用两种方法,不同浓度的TCA和(NH4)2SO4盐析结果显示,蛋白质的洗脱率和多糖的损失率均与TCA和(NH4)2SO4浓度呈正相关。10%的TCA浓度时蛋白洗脱率达到70%以上,SDS-PAGE电泳结果也间接地证实了这一点。但同时,多糖的损失率也随着蛋白洗脱率的增加而增加;PAS染色能看到很明显的红色条带,说明多糖损失较多,超过25%。而90%浓度的(NH4)2SO4能够洗掉绝大部分的蛋白,并且控制多糖损失在20%以内。有利于接下来的分离纯化步骤。发酵上清液经过90%浓度的(NH4)2SO4盐析,透析脱盐,进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,得到单一糖峰和单一蛋白峰,并且糖峰和蛋白峰高度重合,收集重合峰,获得了纯化的胞外多糖蛋白复合物(EP1)。此复合物具有较高的抗自由基活性及抗肿瘤作用。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
1 前言  10-29
  1.1 肿瘤的生物学特性  10-17
    1.1.1 肿瘤的一般形态与结构  10-11
    1.1.2 肿瘤的产生机制  11-15
    1.1.3 肿瘤的生长方式与扩散  15-16
    1.1.4 肿瘤的常见治疗方法  16-17
  1.2 真菌多糖及多糖蛋白复合物的抗肿瘤特性  17-27
    1.2.1 真菌多糖的构效关系  17-19
    1.2.2 抗肿瘤作用的机制  19-21
    1.2.3 真菌多糖蛋白复合物的研究  21-22
    1.2.4 对云芝糖肽（PSP/PSK）的研究  22-27
  1.3 未来研究重点  27
  1.4 选题依据和理论意义  27-29
2 紫芝液体发酵培养基的优化  29-38
  2.1 实验材料与仪器设备  29-30
    2.1.1 菌种来源  29
    2.1.2 仪器设备与试剂  29-30
    2.1.3 培养基  30
  2.2 实验方法  30-32
    2.2.1 菌株的培养及形态观察  30
    2.2.2 菌种保藏  30
    2.2.3 培养基成分的优化  30-31
    2.2.4 紫芝发酵的正交实验  31-32
    2.2.5 发酵罐培养  32
  2.3 实验结果  32-36
    2.3.1 紫芝菌株的斜面培养的生长状况观察  32
    2.3.2 碳源对紫芝发酵的影响  32-33
    2.3.3 氮源对紫芝发酵的影响  33-35
    2.3.4 紫芝发酵的正交实验  35-36
  2.4 紫芝菌株的上罐发酵  36-37
  2.5 小结  37-38
3 紫芝胞外蛋白多糖复合物的制备及分离纯化  38-51
  3.1 实验材料与仪器设备  38-39
    3.1.1 菌种来源  38
    3.1.2 实验试剂  38
    3.1.3 主要仪器与设备  38-39
    3.1.4 发酵培养基成分及发酵培养条件  39
  3.2 测定方法  39-45
    3.2.1 糖浓度的测定  39-40
    3.2.2 蛋白质浓度的测定  40-45
  3.3 实验方法  45-46
    3.3.1 紫芝菌株的发酵培养  45
    3.3.2 紫芝胞外多糖蛋白复合物（EP1）的分离纯化研究  45-46
    3.3.3 紫芝胞外多糖蛋白复合物粗品的制备  46
    3.3.4 柱层析纯化  46
  3.4 实验结果  46-50
    3.4.1 TCA 用量对脱蛋白的影响  46-48
    3.4.2 柱层析纯化  48-50
  3.5 小结  50-51
    3.5.1 紫芝胞外多糖蛋白复合物的初步分离  50
    3.5.2 紫芝胞外多糖蛋白复合物的分离纯化  50-51
4 紫芝胞外多糖蛋白复合物生物活性的研究  51-58
  引言  51
  4.1 材料、试剂与仪器  51-53
    4.1.1 材料  51
    4.1.2 试剂  51-52
    4.1.3 溶液的配置  52
    4.1.4 主要仪器  52-53
  4.2 实验方法  53-54
    4.2.1 紫芝胞外多糖蛋白复合物抗自由基活性的研究  53
    4.2.2 多糖蛋白复合物对 5180 肉瘤细胞生长的影响（MTT 法）  53-54
  4.3 实验结果  54-56
    4.3.1 多糖蛋白复合物抗氧化性的研究  54-55
    4.3.2 多糖蛋白复合物对 5180 肉瘤细胞生长的影响  55-56
  4.4 讨论  56-58
5. 总结  58-60
  5.1 工作总结  58
  5.2 创新点和存在的问题  58-60
参考文献  60-64
致谢  64

紫芝胞外多糖蛋白复合物的制备提纯与生物活性研究

内容摘要

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