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大肠杆菌染色体相互作用高通量筛选模型的建立

作　者: 王东
导　师: 赵志虎
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: 大肠杆菌全基因组构象捕获远距离染色质相互作用基因三维表达调节
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

真核生物细胞核是一种严格区室化、高度不均一的组织结构。在细胞分裂间期,不同的染色质占据不同的相对固定的区域即染色体地域(Chromosome Territory)。近年研究发现在真核生物中存在广泛的染色质之间、染色质之内的相互作用,这种相互作用对基因的表达发挥重要调节作用。作为遗传学上经典的模式生物,大肠杆菌具有其独特的遗传调节特点,其遗传物质主要集中在拟核区域。拟核主要由拟核相关蛋白以及DNA、RNA组成,没有典型的核膜包被。活性转录的RNA聚合酶主要集中在拟核的有限区域,而并不是在细胞中均匀分布。与真核生物不同,大肠杆菌中相关基因组成操纵子作为基因表达调节的基本单位。并且,不同的操纵子可以接受同一调节蛋白的调节而构成调谐元,有时组成同一调谐元的不同操纵子或基因在染色体上相距甚远,相关研究提示这些相距甚远的基因在空间上可能会相互靠近形成依赖转录的Loop结构,但是,更深入的研究这种Loop结构的形成机制、特别是拟核内部的三维结构及其对基因表达的调节规律,目前尚未见相关报道。拟核高级结构的研究对于我们理解大肠杆菌在不同条件下的基因表达调节、掌握其特殊遗传规律并进而改造工程菌等方面均有重要意义。为了对大肠杆菌染色体相互作用、基因组三维高级结构进行系统研究,我们参考染色体构象俘获3C(Chromsome Conformation Capture)技术,利用近距离连接反应的原理,建立了一种高通量的全基因组构象俘获技术GCC-Bac(Genome Conformation Capture: Bacterial Version)。首先,我们以Escherichia coli K-12 MG1655 (ATCC 47076)为研究对象,选择其对数生长期,利用甲醛固定后,超声破碎获得合适大小的DNA片段,末端补平后稀释至极低分子浓度进行分子内连接。解除交联后,克隆至载体测序。我们从216个克隆测序结果中获得了60个克隆属于多基因座位来源的无缝拼接分子。利用生物信息学工具分析,我们认为确实获得了可能受同一转录因子调节的不同操纵子信息。这些结果表明我们初步建立了基于超声破碎的全基因组构象俘获技术。在此基础上,为了与第二代甚至第三代高通量测序技术结合,获得详尽的全基因组范围内的染色质相互作用的信息,我们在交联基因组片段末端插入生物素标签,利用该标签选择性富集可能存在相互作用的不同DNA片段组成的重组分子,以大大提高高通量筛选、序列测定的效率。通过生物素富集片断的有限克隆、筛选与序列测定,结果发现:细菌中存在大量位于不同染色体位置、但受同样的转录因子调节的基因,并且,转录因子结合的順式元件存在一致性基序。依据生物信息学分析结果,我们筛选到的基因,部分属于同一代谢合成通路中不同酶的编码基因,这与目前已知研究结果相符。我们同时发现:许多细菌rRNA基因、蛋白编码基因以及调节基因同时受到相同转录因子调节,这提示我们原核生物边转录边翻译的现象可能是稳定存在的。此外,我们还发现:许多假基因与编基因存在可能相互作用,但是大多数假基因的功能目前尚未十分清楚,因此这种相互作用的生物学意义仍然需要进一步的研究。有限克隆筛选、序列测定及其测定结果的序列分析证实:我们利用近距离连接反应的原理,结合生物素对超声末端的直接标记,建立了适合传统Sanger双脱氧、第二代甚至第三代高通量测序等多种不同测序平台的大肠杆菌染色体相互作用的高通量技术GCC-Bac。高通量筛选技术GCC-Bac的建立,为大肠杆菌远距离染色质相互作用的研究、拟核三维高级结构及其对基因表达调控规律以及基因组高级折叠普遍原则等的揭示提供了重要手段。

全文目录

缩略词  6-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-12
前言  12-18
第一部分 GCC-Bac技术建立及有限克隆筛选验证  18-32
  1. 材料  18-19
    1.1 菌株及质粒  18
    1.2 分子生物学工具酶以及试剂  18
    1.3 常用试剂盒  18
    1.4 主要实验仪器  18-19
  2. 方法  19-22
    2.1 细菌细胞的甲醛固定  19
    2.2 细胞裂解  19
    2.3 超声破碎以及超滤浓缩  19
    2.4 末端补平及分子内连接  19-20
    2.5 DNA-Protein 的分离  20
    2.6 纯化回收样品  20
    2.7 T/A克隆  20
    2.8 T/A克隆效果快速检测  20-21
    2.9 转化以及蓝白斑筛选  21-22
  3. 结果  22-28
    3.1 GCC 的质量控制  22-28
      3.1.1 超声条件的确定与优化  22-23
      3.1.2 补平条件的优化与确定  23-26
      3.1.3 分子内优先连接条件的优化与确定  26-27
      3.1.4 1.0 ng/μl 分子连接浓度下随机分子间连接发生与否的检测  27-28
  4. 讨论  28-31
  5. 小结  31-32
第二部分高通量测序样品的制备  32-70
  第一节限制性内切酶切割制备高通量测序样品策略  32-48
    1. 材料  33-34
    2. 方法  34-38
      2.1 细菌的甲醛固定  34
      2.2 细菌细胞的裂解  34
      2.3 拟核的限制性酶切及分子内连接  34-35
      2.4 解交联以及除去RNA  35
      2.5 生物素掺入以及分子自身连接  35
      2.6 自身连接产物的酶切以及纯化  35-36
      2.7 除去未自身连接的线性分子中的生物素标签  36
      2.8 捕获含生物素标签分子  36
      2.9 捕获样品的有限克隆测序  36-38
    3. 结果  38-46
      3.1 拟核与基因组的酶切效果比较  38
      3.2 拟核与不同的buffer温浴结果比较  38-39
      3.3 拟核与超声buffer中不同成分混合温浴结果比较  39-40
      3.4 拟核经过不同浓度RNaseA消化后的结果比较  40-41
      3.5 基因组与交联拟核经Sau3A I及不同浓度RNaseA消化结果比较  41-43
      3.6 交联拟核酶切产物生物素的掺入、捕获以及克隆筛选  43-46
    4. 讨论  46-48
  第二节利用SDS对交联拟核热处理灭活内源性核酸酶  48-54
    1. 方法  48-49
      1.1 细菌的甲醛固定  48
      1.2 细菌细胞的裂解  48
      1.3 SDS热处理交联拟核  48
      1.4 解交联以及除去RNA  48
      1.5 1%琼脂糖凝胶电泳检测SDS热处理效果  48-49
    2. 结果  49-53
      2.1 不同浓度SDS热处理交联拟核效果比较  49-50
      2.2 SDS热处理交联拟核不同时间效果比较  50-51
      2.3 SDS的残留对于拟核稳定性的影响  51-53
    3. 讨论  53-54
  第三节超声破碎制备高通量测序样品的策略  54-70
    1. 材料  54-59
      2.1 细菌细胞的甲醛固定  55
      2.2 细胞裂解  55
      2.3 超声破碎以及超滤浓缩  55
      2.4 生物素掺入以及分子内近距离连接  55-56
      2.5 样品超声破碎、纯化  56
      2.6 除去单基因座位分子末端的生物素标记  56
      2.7 生物素样品的捕获  56-57
      2.8 捕获样品的有限克隆测序  57-59
    3. 结果  59-67
      3.1 生物素掺入方法优化  59-62
      3.2 反应时间的优化  62-67
    4. 讨论  67-68
    5. 小结  68-70
研究总结  70-72
参考文献  72-78
综述  78-88
  参考文献  83-88
个人简历  88-90
致谢  90

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