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两种可溶性吡啶核苷酸转氢酶的表达、纯化和酶学性质研究

作　者: 曹正宇
导　师: 朱国萍
学　校: 安徽师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 鼠伤寒沙门氏杆菌 大肠杆菌 可溶性吡啶核苷酸转氢酶 酶学性质 黄素蛋白
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


可溶性吡啶核苷酸转氢酶（soluble pyridine nucleotide transhydrogenase, STH or UdhA） （EC 1.6.1.1）是一种黄素蛋白,能特异地催化NADH和NADPH吡啶环上的4B氢可逆转移到NADP+和NAD+上。STH分布范围有限,只分布在γ-变形菌纲和少数革兰氏阳性细菌中,主要参与维持和调节细胞内氧化还原平衡,已被广泛地应用于辅酶再生体系和代谢工程等工业生产中。目前对STH的酶学性质尚未有明确而系统的研究。本实验对鼠伤寒沙门氏杆菌可溶性吡啶核苷酸转氢酶（Salmonella typhimurium STH, StSTH）和大肠杆菌可溶性吡啶核苷酸转氢酶（Escherichia coli STH, EcSTH）进行了表达和纯化,并首次对两者的最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、存储温度、激活剂、抑制剂以及动力学参数进行了细致而全面的研究,为STH的生理功能、催化机制、进化机制以及在工业生产中的应用提供了最基础的参考和依据。酶学研究表明,两种STH的酶学性质是比较相似的。StSTH和EcSTH的最适反应温度分别是32°C和35°C,最适pH分别为7.2和7.5,两者在50°C下的半衰期都是5 h,两者的最佳存储温度都是4°C。两种STH均不是金属离子依赖性的黄素蛋白。在未经预孵育的条件下,大部分金属离子(Mn2+、Co2+、Zn2+、Ni2+和Cu2+)会强烈抑制这两种STH的活性,而腺嘌呤核苷酸（ATP、ADP和AMP）则是这两种STH的强激活剂。研究发现StSTH以乒乓机制催化NADPH和thio-NAD+反应生成NADP+和thio-NADH。StSTH对底物的米氏常数（Km）和表观米氏常数(Kmapp)是比较相似的,其中对NADPH的Km和Kmapp值分别为69.5μM和68.5μM,对thio-NAD+的Km和Kmapp值均为169μM,对底物的转换数(Kcat和Kcatapp)在119-198 s-1之间,也是比较接近的。EcSTH对NADPH和thio-NAD+的Kmapp值分别为68.3μM和133.2μM、Kcatapp分别是167.9 s-1和259.5 s-1。StSTH and EcSTH对NADPH的亲和力均大于对thio-NAD+的亲和力,但是高浓度NADPH会抑制两种STH的活力。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
第一部分 综述  9-29
  1 可溶性吡啶核苷酸转氢酶的结构特征  9-14
    1.1 黄素蛋白-二硫化物还原酶家族蛋白(FDR)的结构特征  9-10
    1.2 可溶性吡啶核苷酸转氢酶的结构特点  10-14
  2 可溶性吡啶核苷酸转氢酶的催化机制  14-16
  3 可溶性吡啶核苷酸转氢酶的生理功能  16-18
    3.1 可溶性吡啶核苷酸转氢酶的分布  16
    3.2 可溶性吡啶核苷酸转氢酶的生理功能  16-18
  4 可溶性吡啶核苷酸转氢酶的工业应用价值  18-20
    4.1 辅酶再生体系的应用  18-19
    4.2 可溶性转氢酶在工业生产中的应用  19-20
  5 鼠伤寒沙门氏菌  20-21
  6 意义与展望  21-22
  参考文献  22-29
第二章 两种可溶性吡啶核苷酸转氢酶的酶学性质分析  29-68
  1 材料与方法  30-44
    1.1 实验材料  30-33
    1.2 实验方法  33-44
  2 结果与分析  44-60
    2.1 Salmonella typhimurium 14028 sth 基因的克隆、表达和酶学鉴定  44-54
    2.2 E. coli STH 的表达、纯化和酶学鉴定  54-60
  3 讨论  60-64
    3.1 STH 分布  60-61
    3.2 序列分析及分子量  61
    3.3 最适pH、最适温度、热稳定性  61-62
    3.4 酶动力学  62-64
  参考文献  64-68
致谢  68-69
附：本人在读期间发表论文、专利、获奖情况和参与科研项目一览表  69

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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