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结直肠癌患者外周血CK20 mRNA表达的相关因素分析及其对预后的预测价值

作　者: 林国乐
导　师: 赵玉沛；邱辉忠
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 普通外科
关键词: 结直肠肿瘤细胞角蛋白20 Ki-67 巢式RT-PCR 免疫组化游离肿瘤细胞血行转移外周血手术治疗 TNM分期预后
分类号: R735.3
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

研究背景结直肠癌在世界范围内都是最常见的恶性肿瘤之一。在欧洲，结直肠癌无论是从发病率还是死亡率而言都是第二常见的恶性肿瘤。在亚洲包括我国，结直肠癌的发病数近几十年上升了2～4倍。虽然结直肠癌的治疗方法不断改进，但患者的生存率仍无明显改善。远处器官（肝、肺等）的血行转移是影响患者预后最常见和最严重的问题之一。因此，早期检测血行转移并推断患者复发的危险性对于结直肠癌的治疗是至关重要的。血循环中游离肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的存在是肿瘤发生血行转移的基础。分子生物学技术的进步尤其是逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）技术的应用，已经使血液中少许肿瘤细胞的检出成为可能。细胞角蛋白20（cytokeratin，CK20）的表达具有严格的上皮组织特异性，在非上皮来源的正常血液中不表达。因此，一旦在结直肠癌患者外周血中检出有CK20 mRNA的阳性表达，即可推断有恶性肿瘤细胞的异位存在。然而，结直肠癌患者无论是在术前还是术中外周血CK20 mRNA表达的生物学意义仍不清楚，其表达的相关因素及其与患者预后的关系尚不明确。Ki-67是一种人类核增殖抗原，可以反映细胞的增殖状态，对于判断肿瘤预后有一定的价值。研究目的探讨结直肠癌患者围手术期外周血CK20 mRNA表达与临床病理特征以及预后的关系，同时了解外周血CK20 mRNA与相应肿瘤组织CK20及Ki-67表达之间的关系，评价外周血CK20 mRNA表达的临床意义，初步探讨其是否可以作为结直肠癌血行转移的预测指标。研究方法建立CK20 mRNA巢式RT-PCR法，应用健康人外周血和结直肠癌HCT-116细胞系评价其检测敏感性。选择57例于2000年4月至2001年3月间在我院手术的散发性结直肠癌患者设为实验组，分别于手术前和术中切除肿瘤以后各抽取10 ml外周血，并收集肿瘤标本，详细登记患者的临床病理资料，术后对患者进行长期随访直至患者死亡或手术后5年底为止。应用巢式RT-PCR法分别检测实验组患者术前和术中外周血CK20 mRNA的表达，并应用免疫组化EnVision^TM法检测相应肿瘤组织CK20和Ki-67的表达。将实验结果与临床病理资料以及长期随访结果进行统计学分析。本研究还选择同一时期收入我院的15例结直肠良性病变患者以及10例健康献血者设为对照组，各抽取10 ml外周血，检测CK20 mRNA的表达。研究结果每1ml健康人外周血中混入5个以上HCT-116结直肠癌细胞，CK20 mRNA巢式RT-PCR法就可以检测到它的存在。实验组57例散发性结直肠癌患者中，男性35例，女性22例，平均年龄（61.0±14.3）岁；结肠癌24例（其中近段结肠癌11例，远段结肠癌13例），直肠癌33例。实验组围手术期外周血CK20 mRNA的总检出率（术前和／或术中检测阳性的例数／总例数）为59.6％（34／57）。术前阳性率为42.1％（24／57），术中增至56.1％（32／57），差异有显著性（McNemar检验，P=0.039）。而结直肠良性病变对照组和健康对照组中均无一例外周血中检测到CK20 mRNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者围手术期外周血CK20 mRNA的阳性率依次为33.3％（2／6）、47.4％（9／19）、63.6％（14／22）、90.0％（9／10），呈逐渐升高的趋势（线性趋势检验，P=0.010）。而且，与未发生转移（Ⅰ、Ⅱ期）的患者相比，已发生淋巴结或血行转移（Ⅲ、Ⅳ期）患者的外周血CK20 mRNA的阳性率显著增高（χ²检验，P=0.033）。而不同肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型和分化程度的结直肠癌患者外周血CK20 mRNA的表达均无显著性差异（P值分别为0.411、0.620、0.449、0.388）。外周血CK20 mRNA的表达与CEA、CA50、CA19-9、CA242等血清肿瘤标志物水平亦无显著性相关（P值均＞0.05）。本组结直肠癌肿瘤组织中CK20和Ki-67的阳性表达率分别为86.0％（49／57）和80.7％（46／57）。结直肠癌肿瘤组织CK20的阳性反应主要定位于细胞浆和细胞膜，少数细胞核亦着色；Ki-67的阳性反应主要定位于细胞核。肿瘤组织中CK20和Ki-67的表达越强，相应患者外周血CK20 mRNA的阳性率越高（P=0.042，P=0.001）。实验组的随访率为96.5％（55／57），其中适合生存分析者53例。外周血CK20mRNA阳性和阴性患者的5年生存率分别为43.8％（14／32）、90.5％（19／21），二者有非常显著性差异（P=0.001）。外周血CK20 mRNA的表达与结直肠癌患者预后显著相关（Kaplan-Meier生存曲线，Log-rank单因素检验）。外周血CK20mRNA阳性患者的总生存时间（overall survival，OS）和无进展生存时间（progression-free survival，PFS）均显著短于阴性患者（P值分别为0.001和0.009）。并且，临床分期（TNM分期）也与结直肠癌患者预后显著相关。分期越晚，患者的OS和PFS越短（P＜O.001，P=0.020）。而且，Ⅲ期及以上分期患者的OS和PFS均显著短于Ⅱ期及以下分期患者（P＜0.001，P=0.007）。不同TNM分期和外周血CK20 mRNA表达情况没有对患者预后产生显著的交互作用（多因素方差分析，P=0.090）。结直肠癌肿瘤组织Ki-67的表达越强患者的OS越短（P=0.010），但肿瘤组织Ki-67的表达与患者的PFS却无明显相关（P=0.598）。COX回归模型分析表明，TNM分期是影响结直肠癌患者预后的独立因素（P=0.018），而外周血CK20 mRNA和肿瘤组织Ki-67的表达未进入最终模型（P值分别为0.284、0.425）。结论1．CK20 mRNA巢式RT-PCR法检测结直肠癌患者外周血中游离肿瘤细胞（CTCs）具有较高的敏感性和特异性。2．结直肠癌患者术中外周血CK20 mRNA的检出率明显高于术前，提示手术操作本身可能增加肿瘤细胞播散入血的机会。3．结直肠癌患者外周血CK20 mRNA表达与TNM分期呈正相关，分期越晚外周血CK20 mRNA的阳性率越高。4．结直肠癌肿瘤组织CK20和Ki-67的表达越强，相应患者外周血CK20mRNA的阳性率越高，提示外周血CK20 mRNA的表达与原发肿瘤细胞的分化和增殖状态密切相关。5．外周血CK20 mRNA阳性表达的结直肠癌患者预后较差。基因检测外周血中CTCs的确切的预后预测价值尚需大规模和长期的临床研究予以证实。

全文目录

英文缩写词表  4-6
中文摘要  6-10
英文摘要  10-15
前言  15-18
材料  18-22
方法  22-38
结果  38-66
讨论  66-75
小结  75-76
问题与展望  76-77
参考文献  77-84
综述  84-106
  综述参考文献  97-106
致谢  106-107

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