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烟草PR-1a蛋白的表达、制备及其性质、功能研究

作　者: 李佳
导　师: 杜林方
学　校: 四川大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 融合表达 PR-1a蛋白大肠杆菌谷胱甘肽S-转移酶纯化荧光光谱抗血清效价免疫印迹抗真菌活性烟草疫霉致病疫霉抑制率孢子三维结构同源模建分子动力学模拟活性位点
分类号: Q946
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

病程相关蛋白（PR蛋白）是由宿主编码的具有种属特异性的植物抗逆蛋白，通常因病毒、真菌或细菌等病原侵染或生理因素、化学因素和物理因素而被诱导表达，它们被认为在防御病原物和抵抗不利环境中具有重要作用。烟草酸性PR-1a蛋白是第一个被纯化和描述的PR蛋白，被作为PR-1蛋白的代表性成员。PR-1蛋白家族是PR蛋白中非常重要的一个家族，通常作为植物系统获得性抗性的标志，但其明确功能和作用机制尚不清楚。为了建立一个高效的PR-1a蛋白原核表达系统及纯化方法来获得重组PR-1a蛋白，本研究将烟草成熟PR-1a蛋白编码区克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-5X-3中，使其与谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase，GST）融合表达（GST-PR1a）。采用设计的两端分别引入BamH1和XhoI酶切位点的引物，以带有烟草PR-1a基因的克隆载体pBluescript SK为模板，成功扩增了烟草成熟PR-1a蛋白的编码序列cDNA（0.43kb）。TA连接，筛选阳性重组子经BamH1和XhoI双酶切后，与同样经BamH1和XhoI双酶切的pGEX-5X-3载体相连并转化E.coli JM109。经双酶切和DNA双向测序，证明成功构建了pGEX-PR1a表达载体。首次将烟草PR-1a蛋白在异源系统中重组表达。选择表达量最高的单菌落为后续实验的表达菌种，优化诱导条件为IPTG终浓度1.0mM，29℃诱导表达4h。GST-PR1a融合蛋白主要存在于上清中，溶解性较好，可能高表达、易溶的谷胱甘肽S-转移酶促进了烟草PR-1a的表达及溶解。诱导表达菌体经超声波破菌，离心，回收上清。由于GST-PR1a融合蛋白含有GST标签，可以通过Glutathione-Sepharose 4B亲和介质层析一步纯化，得到分子量为42 kDa电泳纯的融合蛋白。1L发酵液可获得大约6mg纯化重组蛋白，收率为1.47％。重组蛋白可作为配体用于结合实验和亲和层析，以证明并分离PR-1a蛋白的受体，来研究PR-1a蛋白与其它蛋白质之间的相互作用。用Factor Xa酶切融合蛋白去除GST标签，通过Xarrest^TM琼脂糖将Factor Xa移除，纯化得到分子量为15 kDa的PR-1a蛋白。PR-1a是发现最早的PR蛋白及PR-1家族的代表性成员，但其三维结构以及活性位点的相关信息仍未见报道，而蛋白质的三维结构在很大程度上决定了蛋白质的功能。本研究利用同源模建和分子动力学模拟方法搭建了烟草病程相关蛋白PR-1a的三维结构，以PR-1a序列为探针，搜索得到了同源性为58.7％的病程相关蛋白P14a，由Modeler自动模建程序构建得到的初始模型，经过能量最小化和分子动力学模拟后，得到了PR-1a的最佳构象，选择500皮秒时的构象作为最终构象。优化后得到的三维结构模型用Profile—3D进行了氨基酸残基的兼容性考察，Prostat用来检查所模拟的结构的几何特征，检验结果表明所得理论模型是合理可信的。利用PR-1蛋白家族中一段高度保守的序列GHYTQVVW，使用Binding-Site模块在此基础上分析预测出2个可能的活性位点。从序列分析和几何形状角度分析，推断出位点1（分别是Leu44，His46，His48，Trp72，Asn84，Cys86，His94，Thr96，Gln97，Trp100，Asn129，Tyr130，Pro135，Tyr136）是比位点2更可能的活性位点。获得PR-1a的三维结构信息对深入探讨PR-1a的抗病作用是很有意义的，对病程相关蛋白家族催化机理的深入研究提供了重要的参考信息。对GST-PR1a蛋白和切标签后得到的PR-1a蛋白随温度变化（20℃～100℃保温30min）的荧光发射光谱进行了研究，结果表明，GST-PR1a和切标签后得到的PR-1a分别在20℃～90℃和20℃～60℃处理时的荧光强度与天然状态时相比变化较小，说明分别在以上温度范围中GST-PR1a和PR-1a的构象与天然状态时比较接近。证明PR-1a蛋白稳定性较好，能够抵抗60℃的高温，而且GST标签的加入使稳定性进一步提高。用纯化的GST-PR1a蛋白免疫新西兰大白兔，获得了对GST蛋白和GST-PR1a蛋白效价分别为1：64和1：32的兔抗GST-PR1a抗血清。免疫双扩散和western免疫印迹分析均说明制备得到的pGEX-PR1a抗血清具有较好的特异性。制得的兔抗GST-PR1a抗血清不仅能与GST-PR1a和GST蛋白进行免疫印迹，还能和从天然烟草提取的酸性病程相关蛋白PR-1a、-1b、-1c进行免疫印迹。说明重组GST-PR1a融合蛋白与天然烟草酸性PR-1蛋白（PR-1a、-1b和-1c）具有一致的免疫化学特性。本研究所获得的GST-PR1a融合蛋白和相应抗血清可用于以后GST pull-down分析来探测PR-1a蛋白与其靶蛋白之间的相互作用，为了解PR-1a与其它蛋白质的相互关系提供线索。对GST-PR1a融合蛋白和切标签后得到的PR-1a蛋白进行了体外抗真菌活性初步研究。体外实验结果表明GST-PR1a和切标签后得到的PR-1a蛋白都对烟草疫霉菌丝体的生长没有抑制作用。通过对马铃薯致病疫霉孢子萌发的抑制实验，证明所得到的重组蛋白与天然烟草PR-1蛋白有一致的体外抑菌活性。当GST-PR1a蛋白浓度为600μg／mL时，孢子萌发部分被抑制，芽管长度也有所减短。当切去GST标签即PR-1a浓度在250μg／mL时就几乎能完全阻止孢子的萌发。根据实验数据绘制了GST-PR1a蛋白和切去标签后即PR-1a蛋白对马铃薯致病疫霉的孢子萌发抑制率—蛋白质浓度曲线。PR-1a蛋白的IC₅₀和IC₉₀值分别是100μg／mL和250μg／mL。GST-PR1a融合蛋白对马铃薯疫霉孢子萌发的抑制活性比切去标签后得到的PR-1a蛋白低的多，当GST-PR1a蛋白浓度为600μg／mL时，对孢子萌发抑制率还不到50％。这说明融合蛋白中的GST-tag可能对PR-1a的抗真菌活性有干扰。然而PR-1a蛋白的N-末端有GST-tag时仍然对马铃薯致病疫霉有弱的抑制作用，同时也说明在其抗真菌机制中，PR-1a的N-末端游离并不是必须的。

全文目录

中文摘要  6-10
英文摘要  10-14
第一部分烟草PR-1a载体构建,蛋白表达纯化及制备  14-57
  摘要  15-16
  1 引言  16-17
  2 材料与方法  17-36
  3 结果  36-50
  4 讨论  50-54
  小结  54-55
  参考文献  55-57
第二部分烟草PR-1a蛋白三维模建及活性位点初探  57-68
  摘要  58-59
  1 引言  59-60
  2 材料与方法  60-61
  3 结果  61-65
  4 讨论  65-66
  小结  66-67
  参考文献  67-68
第三部分重组PR-1a蛋白荧光性质研究及抗体制备、鉴定  68-90
  摘要  69-70
  1 引言  70-71
  2 材料与方法  71-77
  3 结果  77-81
  4 讨论  81-87
  小结  87-88
  参考文献  88-90
第四部分重组PR-1a蛋白体外功能研究  90-103
  摘要  91-92
  1 引言  92-93
  2 材料与方法  93-95
  3 结果  95-98
  4 讨论  98-100
  小结  100-101
  参考文献  101-103
文献综述:病程相关蛋白的研究进展和意义  103-161
在读期间专利、论文及获奖情况  161-163
致谢  163

烟草PR-1a蛋白的表达、制备及其性质、功能研究

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