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苏云金芽孢杆菌cry8Ca2基因的活性分析及在转基因烟草中的表达

作　者: 郎志宏
导　师: 黄大昉
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种学
关键词: 苏云金芽孢杆菌 cry8Ca2基因随机突变转基因烟草蛴螬防治
分类号: S476
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 222次
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内容摘要

苏云金芽孢杆菌cry8类基因对叶甲科、金龟科等鞘翅目害虫具有毒杀作用。从菌株HBF-1中克隆的cry8C基因与cry8Cal基因有一个氨基酸的差异，被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry8Ca2基因。本研究对cry8Ca2基因的活性做了进一步分析。利用随机突变方法，得到35个不同的独立克隆，分别在Bt无晶体突变株HD-73~-中表达，通过对铜绿丽金龟幼虫(蛴螬)的生物活性检测，得到两个杀虫活性明显提高的突变体；序列测定结果表明两个突变体分别在第439位的O(Gln)突变为P(Pro)和第642位E(Glu)突变为G(Gly)。以cry8Ca2基因为模板，通过PCR扩增得到九个不同末端缺失的基因片段，构建到pET21b载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达，得到9个末端缺失的蛋白；通过生物活性检测，确定Cry8Ca2蛋白对蛴螬的活性区位于70-659个氨基酸之间。在上述研究的基础上，对编码Cry8Ca2蛋白的1-680氨基酸的核苷酸序列进行了改造和密码子优化，使其在植物中高效表达。优化的mcry8Ca2(modifiedcry8Ca2)与cry8Ca2基因的核苷酸序列同源性只有86.88％，G+C含量也由原来cry8Ca2基因的37％提高到46％。根据己知基因序列设计引物，以烟草基因组DNA为模板，利用PCR方法克隆了根部特异表达的启动子TobRB7，与发表序列有2个碱基的差异，TobRB7启动子与报告基因GUS连接转化烟草，实验证明TobRB7启动子可以驱动GUS基因在烟草根部特异表达。构建了四个植物表达载体pBTmCN(根特异性启动子TobRB7：mcry8Ca基因)、pBSmCN(组成型表达的启动子CaMV35S：mcry8Ca基因)、pBI121载体(CaMV35启动子：GUS基因)和pBTGN(根特异性启动子TobRB7：GUS基因)，其中pBI121和pBTGN载体作为阴性对照，将四个植物表达载体转化烟草，得到了转化植株。对转化植株进行PCR检测，证明外源基因已转入烟草基因组中；Western blot证明Cry8Ca2蛋白在转基因烟草植株中正确表达。将转基因植株接入黄褐丽金龟幼虫和铜绿丽金龟幼虫进行生物活性检测，阴性对照植株被蛴螬明显危害，转mcry8Ca2基因植株根部生长完好，发育正常，结果表明crySCa2基因可以在转基因植株中表达并且对蛴螬有毒杀作用，证明利用转基因植物防治地下害虫蛴螬是一个可行的途径。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
前言  8-17
  1、苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因  8-11
    1.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类  8
    1.2 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的结构  8-9
    1.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的作用机理  9-11
  2、地下害虫蛴螬的危害与防治  11-12
  3、苏云金芽孢杆菌cry8类基因的研究  12-14
  4、Bt转基因植物的研究进展  14-16
    4.1 Bt转基因植物概述  14
    4.2 Bt基因的改造  14-15
    4.3 昆虫对Bt产生抗性的问题  15-16
  5、本研究的目的意义  16-17
第一部分苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry8Ca2的活性研究  17-29
  第一章 cry8Ca2基因的随机突变分析  17-24
    1.1 材料和方法  17-19
    1.2 结果与分析  19-22
    1.3 讨论  22-24
  第二章 Cry8Ca2蛋白活性区的研究  24-29
    2.1 材料和方法  24-26
    2.2 结果与分析:  26-27
    2.3 讨论  27-29
第二部分改造的cry8Ca2基因在转基因烟草中的表达  29-53
  第三章 Bt cry8Ca2基因的改造  29-34
    3.1 材料与方法:  29
    3.2 结果与分析  29-33
    3.3 讨论  33-34
  第四章烟草根特异性启动子的克隆和活性分析  34-41
    4.1 材料和方法  34-37
    4.2 结果与分析  37-40
    4.3 讨论  40-41
  第五章 mcry8Ca2基因在转基因烟草中的活性分析  41-53
    5.1 材料与方法  41-43
    5.2 结果与分析  43-52
    5.3 讨论  52-53
结论  53-54
参考文献  54-59
博士后期间发表的文章和申请专利  59-60
致谢  60

苏云金芽孢杆菌cry8Ca2基因的活性分析及在转基因烟草中的表达

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