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鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究

作　者: 祁小乐
导　师: 王笑梅
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸡传染性法氏囊病病毒 Gt株 反向遗传操作 VP2 VP3 基因功能
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）引起的一种主要危害3-6周龄雏鸡的急性、高度接触性传染病。该病于1957年首发于美国Gumboro地区，50年米，一直威胁着养禽业的发展。免疫抑制、抗原变异，特别是超强毒株（vvIBDV）的出现，使得该病的防控形势更加严峻。国际兽疫局（the Office Internationnal des Epizooties，OIE）将IBD列为“影响社会经济的重要疾病”。关于IBDV的变异以及毒力和细胞嗜性的分子基础，一直是科研工作者研究的重点之一。本课题组的前期研究将超强毒Gx株（vvIBDV）经SPF鸡胚传5代、CEF上传20代驯化致弱为减毒株Gt。Gx株致鸡死亡率高达60％以上且不适应CEF细胞培养，Gt株对鸡无明显毒力且能在CEF上增殖，传代致弱过程中的F9代毒对鸡的毒力显著降低而且适应CEF细胞培养。本研究建立了IBDV基因组长距离高保真PCR方法（LA-PCR），利用此方法克隆了IBDV减毒株Gt的全基因组以及超强毒Gx传代致弱过程中的F9代毒的VP2并对其进行了测序。序列分析发现，与Gx株比较，F9代毒VP2有2个氨基酸突变（Q253H和A284T），Gt株VP2在此基础上又有10个氨基酸突变。另外，Gx株与Gt株在VP3和VP4上各有4个、6个氨基酸差异。本研究的目的是构建高效IBDV反向遗传操作系统，研究VP2、VP3、VP4等基因的序列差异与IBDV细胞嗜性、复制和毒力的关系。目前用于IBDV研究的体外转录、基于T7RNA聚合酶的体内转录、RNA聚合酶Ⅱ体内转录等反向遗传操作系统在病毒拯救效率和操作简便性等方面仍然存在着一些问题。本研究以全新的思路成功构建了RNA polymeraseⅡ介导的IBDV高效反向遗传操作系统。分别在Gt株基因组两端引入了锤头状核酶结构（Hammerhead ribozyme，HamRz）和丁肝病毒核酶结构（Hepatitis delta ribozyme，HdvRz），并将其克隆在真核表达载体pCAGGS的CMV增强子和β肌动蛋白启动子下游，构建IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT，经Plasmid Midi Kit（QlAGEN）纯化后，在LipofectamineTM 2000（Invitrogen）的介导下，直接转染DFI细胞，72h后取上清继续在CEF上传代。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV，且存在分子标签。拯救毒在CEF上能产生特有的砂砾状CPE，且与亲本毒Gt有一致的复制动力学曲线。该系统高效、简便、稳定，具有良好的细胞普适性，能在DFI、Vero/E6、Vero/P12等多种细胞上高效拯救出病毒。IBDV高效反向遗传操作系统的建立为深入研究IBDV的基因功能奠定了基础，也为其它双RNA病毒的反向遗传操作提供借鉴。采用融合PCR（fusion PCR）的方法对Gx、F9、Gt等三个毒株的VP2基因进行了相互替换，利用所建立的反向遗传操作系统，拯救出了三个VP2基因嵌合病毒rGx-F9VP2、rGx-GtVP2、rGt-F9VP2。通过复制动力学试验和SPF鸡攻毒试验，证明：VP2的253和284位氨基酸决定IBDV细胞嗜性，Q253H和A284T可使vvIBDV适应CEF培养，并且具有明显的减毒作用；VP2的A222P、I242V、I256V、D279N、I294L、S299N、S330R等七个氨基酸变化可促进IBDV在CEF上的复制，这七个位点也与IBDV的毒力相关。另外，将vvIBDV Gx株的VP3/3’NCR、VP4/VP3/3’NCR、VP4替换Gt株的相应区域，利用上述反向遗传操作系统，拯救出三个嵌合病毒rGt-GxVP3/3’NCR、rGt-GxVP4/VP3/3’NCR、rGt-GxVP4。通过病毒复制动力学试验和对SPF鸡攻毒试验，证明VP3与IBDV在CEF上的复制相关（其中P981L可能有正向促进作用）；VP3不影响IBDV的毒力；VP4不影响IBDV的毒力以及在CEF上的复制，对VP3亦无协同作用。本研究用全新的思路成功构建了RNA polymeraseⅡ介导的IBDV反向遗传操作系统，并对IBDV VP2、VP3、VP4的功能作了研究，对全面了解IBDV的结构与功能，明确IBDV变异的分子基础，揭示IBDV致病与免疫的分子机制，探索IBDV分子致弱方法，研发适合于流行毒株的新型疫苗具有重要意义。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-17
第一章 绪论  17-33
  1.1 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)研究进展  17-23
    1.1.1 IBDV的形态结构  18
    1.1.2 IBDV的基因组结构  18-19
    1.1.3 IBDV的编码蛋白及非编码区  19-23
  1.2 动物RNA病毒的反向遗传操作系统  23-26
    1.2.1 体外转录拯救系统  23-24
    1.2.2 基于T7 RNA聚合酶的体内转录系统  24-25
    1.2.3 RNA聚合酶Ⅰ拯救系统  25-26
    1.2.4 RNA聚合酶Ⅱ拯救系统  26
  1.3 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的拯救系统  26-27
  1.4 鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的反向遗传操作研究  27-31
    1.4.1 关于IBDV细胞嗜性的研究  27-28
    1.4.2 关于IBDV毒力分子基础的研究  28-29
    1.4.3 标记疫苗研究  29-30
    1.4.4 对非编码区功能的研究  30-31
  1.5 问题与展望  31-32
  1.6 本研究的目的和意义  32-33
第二章 鸡传染性法氏囊病病毒GT株全基因组克隆与序列分析  33-40
  2.1 材料与方法  33-36
    2.1.1 病毒、细胞、质粒和菌种  33
    2.1.2 工具酶与主要试剂  33-34
    2.1.3 主要仪器  34
    2.1.4 引物设计与合成  34
    2.1.5 IBDV全基因组RNA的提取  34-35
    2.1.6 IBDV全基因组的反转录  35
    2.1.7 IBDV全基因组cDNA的扩增与克隆  35
    2.1.8 F9代毒VP2基因的扩增与克隆  35-36
    2.1.9 IBDV Gt株全基因组及F9代毒VP2序列分析  36
  2.2 结果  36-39
    2.2.1 IBDV Gt株全基因组的克隆  36
    2.2.2 F9代毒VP2基因的克隆  36-37
    2.2.3 基因组遗传演化分析  37-38
    2.2.4 基因组序列分析  38-39
  2.3 讨论  39-40
第三章 鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立  40-56
  3.1 材料与方法  41-47
    3.1.1 病毒、细胞与单克隆抗体  41
    3.1.2 质粒和菌种  41
    3.1.3 工具酶与主要试剂  41
    3.1.4 主要仪器  41
    3.1.5 引物设计与合成  41-42
    3.1.6 分子标签引入  42-43
    3.1.7 核酶结构引入  43-44
    3.1.8 全基因组真核表达载体的构建  44-45
    3.1.9 病毒拯救  45-46
    3.1.10 拯救病毒RT-PCR及分子标签鉴定  46
    3.1.11 拯救病毒间接免疫荧光鉴定  46
    3.1.12 拯救病毒电镜检查  46
    3.1.13 拯救毒与亲本毒复制动力学比较  46-47
    3.1.14 IBDV反向遗传操作系统的细胞普适性与稳定性  47
  3.2 结果  47-52
    3.2.1 IBDV全基因组分子标签的引入  47-48
    3.2.2 核酶结构的引入  48
    3.2.3 全基因组真核表达载体的构建  48
    3.2.4 病毒的拯救  48-49
    3.2.5 拯救病毒RT-PCR及序列测定  49
    3.2.6 拯救病毒间接免疫荧光鉴定  49-51
    3.2.7 拯救病毒电镜检查  51
    3.2.8 拯救毒与亲本毒复制动力学比较  51
    3.2.9 IBDV反向遗传操作系统的细胞普适性与稳定性  51-52
  3.3 讨论  52-56
    3.3.1 RNA聚合酶Ⅱ介导的IBDV拯救系统  52-53
    3.3.2 点突变方法与分子标签  53
    3.3.3 核酶与基因组的完整性  53
    3.3.4 基因组的保真性与病毒的拯救  53-54
    3.3.5 IBDV反向遗传操作系统的细胞普适性与高效率  54
    3.3.6 影响病毒拯救效率的其他因素  54-55
    3.3.7 判定病毒拯救成功的指标  55-56
第四章 鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因功能的研究  56-79
  4.1 材料与方法  57-63
    4.1.1 病毒、细胞和质粒  57
    4.1.2 SPF鸡  57
    4.1.3 工具酶与主要试剂  57
    4.1.4 主要仪器  57
    4.1.5 引物设计与合成  57-58
    4.1.6 Gt株VP2替换Gx株VP2  58-60
    4.1.7 F9代毒VP2替换Gx株VP2  60-61
    4.1.8 F9代毒VP2替换Gt株VP2  61
    4.1.9 Gx株B节段真核表达载体的构建  61
    4.1.10 VP2基因替换的嵌合病毒拯救  61-62
    4.1.11 嵌合病毒的鉴定  62
    4.1.12 嵌合病毒复制动力学试验  62
    4.1.13 嵌合病毒毒力试验  62
    4.1.14 试验鸡法氏囊病毒分离  62
    4.1.15 试验鸡法氏囊RT-PCR与序列测定  62-63
    4.1.16 试验鸡血清抗体效价的测定  63
  4.2 结果  63-73
    4.2.1 替换Gt株VP2的Gx株A节段真核表达载体的构建  63
    4.2.2 替换F9代毒VP2的Gx株A节段真核表达载体的构建  63-64
    4.2.3 替换F9代毒VP2的Gt株A节段真核表达载体的构建  64-65
    4.2.4 Gx株B节段真核表达载体的构建  65
    4.2.5 VP2基因替换的嵌合病毒拯救  65
    4.2.6 嵌合病毒的RT-PCR及序列测定  65-66
    4.2.7 嵌合病毒的间接免疫荧光鉴定  66
    4.2.8 嵌合病毒的电镜观察  66-67
    4.2.9 嵌合病毒复制动力学研究  67-68
    4.2.10 试验鸡的症状  68
    4.2.11 试验鸡的剖检病变  68-70
    4.2.12 试验鸡的囊重比与囊指数  70
    4.2.13 试验鸡法氏囊的组织病理变化  70-72
    4.2.14 试验鸡法氏囊病毒分离  72
    4.2.15 试验鸡法氏囊的RT-PCR与序列测定  72
    4.2.16 试验鸡血清抗体效价的测定结果  72-73
  4.3 讨论  73-79
    4.3.1 VP2的253和284位氨基酸决定IBDV细胞嗜性  73-74
    4.3.2 VP2的222等7个氨基酸与IBDV在CEF上的复制有关  74-75
    4.3.3 VP2的253和284位氨基酸是IBDV的重要毒力位点  75
    4.3.4 VP2的222等7个氨基酸是IBDV潜在的毒力位点  75-76
    4.3.5 VP2不是影响IBDV复制和毒力的唯一因素  76
    4.3.6 氨基酸突变影响IBDV细胞嗜性、复制和毒力的可能机理  76-77
    4.3.7 融合PCR与基因替换  77-78
    4.3.8 不完全酶切在基因克隆中的应用  78-79
第五章 鸡传染性法氏囊病病毒VP3和VP4基因功能的研究  79-89
  5.1 材料与方法  79-82
    5.1.1 病毒、细胞和质粒  79
    5.1.2 SPF鸡  79
    5.1.3 工具酶与主要试剂  79-80
    5.1.4 主要仪器  80
    5.1.5 Gx株和Gt株A节段的亚克隆  80
    5.1.6 Gx株VP3/3’NCR替换Gt株相应区域  80
    5.1.7 Gx株VP4/VP3/3’NCR替换Gt株相应区域  80
    5.1.8 Gx株VP4替换Gt株相应区域  80
    5.1.9 嵌合A节段核酶结构的引入  80-81
    5.1.10 嵌合A节段真核表达载体的构建  81
    5.1.11 嵌合病毒的拯救  81
    5.1.12 嵌合病毒的鉴定  81-82
    5.1.13 嵌合病毒复制动力学研究  82
    5.1.14 嵌合病毒毒力研究  82
    5.1.15 试验鸡法氏囊病毒分离与鉴定  82
    5.1.16 试验鸡法氏囊RT-PCR与序列测定  82
    5.1.17 试验鸡的血清抗体效价测定  82
  5.2 结果  82-86
    5.2.1 嵌合A节段真核表达载体的构建  82
    5.2.2 嵌合病毒的拯救  82-83
    5.2.3 嵌合病毒RT-PCR及序列测定  83-84
    5.2.4 嵌合病毒的间接免疫荧光鉴定  84
    5.2.5 嵌合病毒的电镜观察  84
    5.2.6 嵌合病毒复制动力学研究  84-85
    5.2.7 试验鸡的症状与剖检变化  85-86
    5.2.8 试验鸡的囊重比与囊指数  86
    5.2.9 试验鸡法氏囊的RT-PCR与序列测定  86
    5.2.10 试验鸡法氏囊的病毒分离  86
    5.2.11 试验鸡的血清抗体效价  86
  5.3 讨论  86-89
    5.3.1 VP3影响IBDV在CEF上的复制  86-88
    5.3.2 VP4不影响IBDV在CEF上的复制  88
    5.3.3 VP3、VP4不影响IBDV的毒力  88-89
第六章 结论  89-90
参考文献  90-103
附录  103-123
致谢  123-124
作者简历  124-125

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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