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鸡Toll样受体3的克隆及其参与IBDV感染的初步研究

作　者: 甘珊珊
导　师: 何秀苗
学　校: 广西民族大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 关鸡Toll样受体3 荧光定量PCR 鸡传染性法氏囊病病毒鸡外周血淋巴细胞细胞因子
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs)是参与先天性免疫的重要跨膜受体及信号转导受体,也是识别病原相关分子模式(PAMP)的重要受体之一,它不仅参与天然免疫,而且是连接天然免疫和获得性免疫的重要桥梁。Toll样受体3(TLR3)主要识别双链RNA。鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)基因组为双链RNA,而IBDV引起的传染性法氏囊病(IBD)是目前危害养鸡业最大的免疫抑制性疾病之一,目前对IBDV致病机制的认识并不全面,特别是宿主在疾病发生过程中的作用信息。本研究旨在探讨广西三黄鸡TLR3的结构特点,初步研究外周血淋巴细胞中,IBDV感染与鸡TLR3信号通路之间的关系,为深入揭示IBDV的发病机制,进一步探索防治IBD途径提供新的思路。研究首先通过降落PCR技术从广西三黄鸡外周血淋巴细胞中分段扩增TLR3基因,并对其进行克隆、功能区的原核表达及多克隆抗体的制备。结果,获得的广西三黄鸡TLR3(GX-sh-chTLR3)基因全长为3036bp,与已报道鸡TLR3序列同源性达到96.5～99.7%,差异主要集中在胞外区前173位氨基酸;与牛、鼠、绵羊、猪、马、家兔、黑猩猩、人、大猩猩的氨基酸同源性较低,为68～74.8%;在遗传进化分析中,禽TLR3与人类及其它动物TLR3分属于两大分支,处于不同进化位置。结构预测表明,GX-sh-chTLR3具有明显的跨膜蛋白结构,胞外区蛋白由外侧多个α螺旋和内侧凹陷多个β折叠构成螺线管状马鞍形结构。构建鸡TLR3抗原识别关键区域的原核表达载体,将其诱导表达的产物免疫小鼠所制备的鼠抗鸡TLR3多抗具有良好的特异性,并能与鸡成纤维细胞中的TLR3蛋白发生特异性反应。该研究结果为深入研究鸡TLR3的结构和功能以及鸡TLR3在禽类疾病中的作用提供重要的材料基础。研究还通过荧光定量PCR(real time RT-PCR)技术,对鸡外周血淋巴细胞中的IBDV感染与TLR3表达之间的关系进行了研究:我们首先建立了基于IBDV-VP2基因的IBDV定量检测的标准曲线,通过灵敏度和重复性实验证实,标准曲线的特异性高、灵敏度好、具有很好的稳定性,可以用于IBDV的定量检测。其次,对IBDV感染体外培养的鸡外周血淋巴细胞后,病毒的复制情况、TLR3的mRNA表达及其下游效应因子的表达情况进行检测。结果表明,在IBDV感染后6h收获的细胞,细胞病毒基因组拷贝数最高,TLR3表达量也最高。而TLR3的下游效应因子IL-8和IFNβ的变化则不同,经IBDV感染后3h时收获的细胞IFNβ表达显著提高,此时,IL-8稍有上调,而6h时IL-8的表达量达到最高。IBDV感染后,TLR3的下游效应因子IFNβ和IL-8的表达规律不一致,表明,IBDV感染后,可能通过不同的TLR3通路启动不同的细胞应答反应,而这一反应结果将直接影响到病毒在细胞上的命运。最后,我们用不同毒力的IBDV感染细胞,并选择病毒拷贝数达高峰时收获细胞,对不同毒力IBDV在细胞上复制的差异性进行定量检测,并检测TLR3及其下游效应因子的表达差异。结果,超强毒株NN0704感染后引起的TLR3信号通路最强,显著高于中等偏强毒力株NN040124和中等毒力疫苗株B87(in)的感染。而不同毒力株在细胞中的复制水平也出现同样的规律。表明,在IBDV感染的淋巴细胞中,TLR3通路的强弱与病毒毒力呈正相关,毒力越强,引起的细胞应答反应越强烈。综上所述,外周血淋巴细胞中,IBDV通过TLR3通路触发细胞的相应免疫反应,而信号的强弱及其引起细胞应答反应的强弱与病毒的毒力相关。这些研究结果将为进一步研究TLR3参与IBDV致病的分子机制奠定基础,同时也为探索新的预防IBDV的方法提供新的思路。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-13
前言  13-14
1 禽类 Toll 样受体及其研究进展  14-24
  1.1 Toll 样受体发现及配体识别  14-15
  1.2 禽类Toll 样受体及其作用  15-22
    1.2.1 TLR1  15
    1.2.2 TLR2  15-16
    1.2.3 TLR3  16-19
    1.2.4 TLR4  19
    1.2.5 TLR5  19-20
    1.2.6 TLR7  20-21
    1.2.7 TLR9  21
    1.2.8 鸡其它TLRs  21-22
  1.3 禽类TLRs 研究的展望  22
  1.4 本研究的目的及意义  22-23
  1.5 技术路线  23-24
2 鸡 TLR3 全基因扩增、克隆表达及多克隆抗体制备  24-50
  2.1 实验材料  24-25
  2.2 实验方法  25-34
    2.2.1 鸡外周血淋巴细胞（PBLs）提取  25-26
    2.2.2 鸡外周血淋巴细胞总RNA 提取  26
    2.2.3 RT-PCR 分段扩增GX-sh-chTLR3 片段  26-27
    2.2.4 分段克隆GX-sh-chTLR3 全长片段及鉴定  27-29
    2.2.5 GX-sh-chTLR3 序列分析及功能区预测  29
    2.2.6 GX-sh-chTLR3 的chTLR3-LRR 片段扩增  29-30
    2.2.7 原核表达重组质粒的构建  30-31
    2.2.8 pET-chTLR3-LRR 阳性克隆鉴定  31
    2.2.9 pET-chTLR3-LRR 重组蛋白诱导表达  31
    2.2.10 SDS-PAGE 检测蛋白表达  31-32
    2.2.11 蛋白表达条件优化  32
    2.2.12 多克隆抗体制备  32-33
    2.2.13 Western-blot 检测抗体  33
    2.2.14 多抗与TLR3 蛋白的反应性检测  33-34
  2.3 实验结果  34-47
    2.3.1 RT-PCR 扩增A，B，C 目的片段  34-35
    2.3.2 重组质粒的鉴定  35-36
    2.3.3 GX-sh-chTLR3 的序列分析  36-40
    2.3.4 GX-sh-chTLR3 蛋白疏水性和跨膜区分析结果  40-41
    2.3.5 GX-sh-chTLR3 蛋白质二级结构的预测分析结果  41-42
    2.3.6 GX-sh-chTLR3 蛋白质空间结构预测分析结果  42-43
    2.3.7 RT-PCR 扩增chTLR3-LRR 片段及其重组质粒的鉴定  43-44
    2.3.8 SDS-PAGE 检测蛋白表达  44-45
    2.3.9 重组蛋白最佳诱导条件优化  45-46
    2.3.10 重组蛋白多克隆抗体的Western-blotting 检测结果  46-47
  2.4 小结与讨论  47-50
3 IBDV 毒株 VP2 基因 Q-RT-PCR 标准曲线的建立  50-60
  3.1 实验材料  50-51
  3.2 实验方法  51-53
    3.2.1 病毒RNA 的提取  51
    3.2.2 RT-PCR 扩增IBDV-VP2 基因  51-52
    3.2.3 PCR 产物的克隆及鉴定  52
    3.2.4 IBDV-VP2 质粒标准品制备  52
    3.2.5 IBDV-VP2 质粒标准品荧光定量PCR 反应条件的建立  52-53
    3.2.6 灵敏度和重复性实验  53
  3.3 实验结果  53-58
    3.3.1 IBDV-VP2 基因的RT-PCR 扩增结果  53-54
    3.3.2 IBDV-VP2 基因的克隆及酶切鉴定  54
    3.3.3 标准品OD 值的测定及浓度的确定  54-55
    3.3.4 质粒标准品荧光定量PCR 方法的建立结果  55-58
  3.4 小结与讨论  58-60
4 荧光定量 PCR 法检测鸡 TLR3 与 IBDV 相关性初步研究  60-79
  4.1 实验材料  60-61
  4.2 实验方法  61-66
    4.2.1 鸡外周血淋巴细胞的原代培养及IBDV 病毒的感染  61-62
    4.2.2 IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，病毒复制规律的测定  62
    4.2.3 IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，TLR3 的表达动态测定  62-64
    4.2.4 IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，细胞中TLR3 下游效应因子的表达量检测  64
    4.2.5 不同毒力株 IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，病毒复制量测定  64-65
    4.2.6 不同毒力株IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，TLR3 的表达量测定  65
    4.2.7 不同毒力株IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，细胞中TLR3 下游效应因子的表达量测定  65
    4.2.8 荧光定量PCR 数据分析方法  65-66
  4.3 实验结果  66-76
    4.3.1 RT-PCR 扩增TLR3、IL-8、IFNβ目的片段  66
    4.3.2 IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，病毒复制规律的结果分析  66-68
    4.3.3 IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，TLR3 的动态表达结果分析  68-69
    4.3.4 IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，细胞中TLR3 下游效应因动态表达结果分析  69-71
    4.3.5 不同毒力株IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，病毒复制的结果分析  71-73
    4.3.6 不同毒力株IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，TLR3 的表达结果分析  73-74
    4.3.7 不同毒力株IBDV 感染鸡外周血淋巴细胞后，IFNβ和IL-8 的表达结果分析  74-76
  4.4 小结与讨论  76-79
    4.4.1 结果分析与讨论  76-78
    4.4.2 方法讨论  78-79
5 结论  79-80
参考文献  80-87
致谢  87-88
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