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盐生植物（补血草与盐地碱蓬）耐盐基因的发掘及应用

作　者: 郭善利
导　师: 赵彦修；张慧
学　校: 山东师范大学
专　业: 植物学
关键词: 盐生植物 补血草 盐地碱蓬 杨树 EST 液泡膜焦磷酸酶 SsNHX1 植物耐盐性和耐旱性
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 630次
引　用: 3次
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内容摘要


土壤盐渍化是影响农林业生产,导致农林业生物量减少的主要非生物胁迫因子之一。盐分胁迫主要包括渗透胁迫、离子胁迫及其造成的一系列次级胁迫如氧化胁迫等,严重干扰植物体内业已存在的细胞及整株水平上的水分及离子稳态,造成植物细胞分子损伤,生长延滞甚至死亡。植物耐盐基因工程被认为是培育耐盐植物、开发利用盐碱荒地最有效、最经济的手段,但有效目的基因的缺乏,特别是来自盐生植物的耐盐基因,是限制植物耐盐基因工程发展的一大障碍。本论文的主要目的是利用真盐生植物补血草建立EST 数据库,结合盐生植物盐地碱蓬的EST 数据库,发掘来自盐生植物的耐盐基因,并且在林木模式植物杨树遗传转化方面做一些有益的尝试。1. 补血草(Limonium sinense)EST数据库的构建构建了一个补血草叶片的cDNA 文库,并从中随机挑选克隆单向测序,获得了1162 个EST序列,其中405 个EST序列与以前鉴定的基因序列具有很高的同源性。通过序列分析,鉴定了739 个独立的EST 序列,其中194 个序列与以前鉴定的基因具有同源性。所有的EST数据都将公布在GeneBank 的dbEST中。耐胁迫调控基因的EST划分为7 个主要的类别,占EST总数的3.4 %。2. 盐地碱蓬(Suaeda salsa)液泡膜焦磷酸酶基因的克隆与鉴定从400mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬地上部分构建的λZap-cDNA文库中克隆了编码液泡膜H~+-PPase 的部分cDNA(SsVP),据已知序列设计引物利用PCR方法获得编码盐地碱蓬液泡膜H~+-PPase 的全长cDNA。对该基因的序列特征、基因组结构和在盐胁迫下的表达特性做了详细的分析。结果表明:SsVP 与已报道的红叶藜(Chenopodium rubrum)的液泡膜H~+-PPase 基因(CVP)同源性最高,Clustalx 软件对不同物种中液泡膜H~+-PPase 基因所作的系统进化分析表明SsVP与CVP 聚为一簇,均属于类型Ⅰ类液泡膜H~+-PPase;Southern杂交表明该基因在盐地碱蓬基因组中可能是多拷贝的;Northern杂交结果表明在盐胁迫和干旱胁迫下SsVP 的转录都是上行调节的,400mmol NaCl处理和干旱处理下,盐地碱蓬地上部分中SsVP 的mRNA增加。将SsVP 的全长cDNA克隆入植物表达载体pCAMBIA1300 中,导入根瘤农杆菌GV3101后,由花浸泡法进行拟南芥遗传转化,转化SsVP 的拟南芥在含潮

全文目录


中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
第一部分 文献综述  14-50
  1 耐盐遗传基础问题  15-19
    1.1 耐盐性遗传的早期研究  15
    1.2 耐盐性遗传分析  15-19
      1.2.1 分子标记(molecular marker)的应用  16-17
      1.2.2 用转基因的方法研究植物耐盐性  17-19
        1.2.2.1 过量表达(overexpression)某些基因研究植物耐盐性  17-18
        1.2.2.2 基因沉默(gene silencing)  18-19
  2 植物耐盐机制  19-37
    2.1 植物对盐胁迫的反应及适应  19-22
      2.1.1 植物对盐胁迫的反应  19-21
        2.1.1.1 盐胁迫影响植物形态发育  19-20
        2.1.1.2 盐胁迫影响植物的生理生化代谢  20-21
      2.1.2 植物对盐胁迫的适应  21-22
        2.1.2.1 泌盐  21
        2.1.2.2 稀盐  21-22
        2.1.2.3 拒盐  22
    2.2 离子均衡及其调控  22-34
      2.2.1 跨膜质子电化学梯度的重建  23-27
        2.2.1.1 质膜H~+-ATPase  23
        2.2.1.2 液泡膜H~+-ATPase  23-24
        2.2.1.3 液泡膜H~+-PPase  24-26
        2.2.1.4 液泡膜H~+-ATPase 和H~+-PPase 的关系  26-27
      2.2.2 Na~+、K~+ 的稳态  27-31
        2.2.2.1 Na~+ 跨膜内流与K~+ 吸收  27-28
        2.2.2.2 Na~+ 的外排  28-29
        2.2.2.3 Na~+ 的区隔化  29-30
        2.2.2.4 K~+ 的稳态  30-31
      2.2.3 Cl~-的吸收和区隔化  31
      2.2.4 Ca~(2+) 的均衡  31-32
      2.2.5 SOS 信号通路与离子稳态的调节  32-34
    2.3 渗透平衡的重建及调节途径  34-37
      2.3.1 渗透调节物质的合成及渗透平衡  34-35
      2.3.2 与渗透平衡有关的调节途径  35-37
        2.3.2.1 ABA 与渗透平衡调节  35-36
        2.3.2.2 蛋白激酶途径  36-37
        2.3.2.3 磷脂酶途径  37
  3. 植物cDNA 文库构建与目的基因克隆  37-40
    3.1 基因文库的分类  38
    3.2 植物cDNA 文库构建的基本过程  38
    3.3 EST 的概念与技术原理  38-40
      3.3.1 EST 的概念  38-39
      3.3.2 EST 的技术原理  39
      3.3.3 EST 的应用  39-40
        3.3.3.1 构建遗传学图谱与基因定位  39-40
        3.3.3.2 分离与鉴定新基因  40
        3.3.3.3 基因表达谱的研究  40
        3.3.3.4 功能基因学和比较功能组学的研究  40
        3.3.3.5 EST 在林木研究中的应用  40
  4. 杨树抗性基因工程研究进展  40-50
    4.1 林木基因转化技术  41-42
      4.1.1 农杆菌介导法  41-42
      4.1.2 DNA 直接导入法  42
    4.2 杨树转基因研究应用  42-49
      4.2.1 抗虫转基因研究  42-45
      4.2.2 抗病转基因研究  45
      4.2.3 抗除草剂转基因研究  45-46
      4.2.4 抗盐和抗渗透胁迫转基因研究  46-47
      4.2.5 材性改良和木质素基因转化研究  47-48
      4.2.6 杨树其他基因的转化研究  48-49
    4.3 杨树基因转化研究中存在的问题  49-50
第二部分 实验论文  50-99
  第一章 补血草(Limonium sinense)EST 数据库的构建  51-67
    1 实验材料  51-53
    2 实验方法与步骤  53-57
      2.1 补血草总RNA 的提取  53-54
      2.2 Poly(A+) RNA 分离  54
      2.3 cDNA 库构建  54-55
        2.3.1 cDNA 第一链的合成  54
        2.3.2 cDNA 第二链的合成  54
        2.3.3 双链cDNA 末端补平  54-55
        2.3.4 EcoRI 接头的加接  55
        2.3.5 双链cDNA 末端的磷酸化和XhoI 酶切  55
        2.3.6 胶回收目的片断  55
        2.3.7 连接和转化  55
      2.4 菌落PCR 检测  55-56
      2.5 文库产品  56
      2.6 质粒DNA 测序  56
      2.7 序列编辑和BLAST 分析  56-57
        2.7.1 GeneTool 分析  56
        2.7.2 BLAST 分析  56-57
        2.7.3 DNA alignment 分析  57
    3 实验结果与分析  57-65
      3.1 测序结果和BLAST 分析结果  57-64
      3.2 耐胁迫基因ESTs  64
      3.3 Digital Northern 分析和DNA alignment 分析结果  64-65
    4 讨论  65-67
  第二章 盐地碱蓬(Suaeda salsa)液泡膜焦磷酸酶基因的克隆与鉴定  67-86
    1 实验材料  67-68
    2. 实验方法  68-75
      2.1 大肠杆菌感受态的制备及转化  68
      2.2 碱裂解法提取质粒  68-69
      2.3 质粒DNA 测序  69
      2.4 Gene Clean 法回收目的cDNA 片段  69
      2.5 农杆菌感受态的制备及转化  69-70
      2.6 植物基因组DNA 的提取  70
      2.7 Southern 杂交分析  70-71
        2.7.1 杂交膜的制备  70
        2.7.2 探针的制备  70-71
        2.7.3 杂交过程  71
      2.8 异硫氰酸胍法提取植物的总RNA  71-72
      2.9 Northern 杂交分析  72
        2.9.1 在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳  72
        2.9.2 RNA 杂交膜的制备  72
        2.9.3 杂交过程  72
      2.10 液泡膜H~+ -ATPase、H~+ -PPase 水解活性的测定  72-73
        2.10.1 液泡膜微囊的制备  72-73
        2.10.2 蛋白质含量的测定  73
        2.10.3.V -ATPase 和V-PPase 水解活性的测定  73
      2.11. Western blot 分析  73-74
      2.12 SsVP 植物表达载体的构建及农杆菌的转化  74
        2.12.1 SsVP 植物表达载体的构建  74
        2.12.2 农杆菌的转化  74
      2.13 拟南芥的培养及转化  74-75
        2.13.1 植物的生长  74
        2.13.2 菌液的准备  74
        2.13.3 渗透转化  74-75
        2.13.4 转化子的筛选  75
      2.14 转基因植株的检测  75
        2.14.1 转化子的遗传分析  75
        2.14.2 转基因植株的PCR 检测  75
        2.14.3 转基因植株的Northern 杂交鉴定  75
    3. 实验结果与分析  75-84
      3.1 盐地碱蓬SsVP cDNA 克隆的分离和鉴定  76-78
      3.2 SsVP 的基因组Southern 杂交分析  78-79
      3.3 SsVP 基因在盐和干旱处理下的特异性表达  79
      3.4 SsVP 基因在拟南芥中的过量表达  79-84
        3.4.1 植物表达载体的构建  79-80
        3.4.2 转SsVP 基因拟南芥的筛选  80-81
        3.4.3 NaCl 和干旱胁迫对转SsVP 基因拟南芥V-ATPase、V-PPase 活性的影响  81
        3.4.4 过量表达SsVP 明显提高了转基因拟南芥植株的耐盐性  81
        3.4.5 过量表达SsVP 提高了转基因拟南芥植株的干旱抗性  81-84
    4. 讨论  84-86
  第三章 盐地碱蓬SsNHX1 基因导入杨树的研究  86-99
    1 实验材料  86-87
    2 实验方法  87-92
      2.1 基本分子生物学实验技术  87-89
        2.1.1 改良CTAB 法微量提取杨树DNA  87-88
        2.1.2 Trizol 法提取RNA  88
        2.1.3 转基因杨树的分子检测  88
        2.1.4 转基因杨树的PCR 检测  88
        2.1.5 转基因杨树的RT-PCR 检测  88-89
        2.1.6 SsNHX1 基因的获得  89
        2.1.7 植物表达载体pROKII-SsNHX1 的构建  89
        2.1.8 植物表达载体的农杆菌转化  89
        2.1.9 菌种的保存  89
      2.2 建立杨树的遗传转化体系  89-90
        2.2.1 外植体冲洗与消毒  89-90
        2.2.2 预培养  90
        2.2.3 农杆菌转化方法  90
      2.3 转基因杨树的处理  90
      2.4 对照与转基因杨树叶片干重、鲜重的测定  90-91
      2.5 对照与转基因杨树Na~+、K~+离子含量的测定  91
      2.6 对照与转基因杨树MDA 含量的测定  91
      2.7 对照与转基因杨树光合水平的测定  91
      2.8 对照与转基因杨树脯氨酸含量的测定  91
      2.9 细胞膜透性的测定  91-92
    3. 实验结果与分析  92-97
      3.1 杨树的遗传转化及转基因杨树的分子检测  92-93
        3.1.1 杨树转化  92
        3.1.2 转基因杨树的RT-PCR 检测  92
        3.1.3 转基因杨树的Northern 杂交  92-93
      3.2 转基因杨树的耐盐性分析  93-97
        3.2.1 NaCl 对转SsNHX1 基因杨树生长的影响  93
        3.2.2 盐处理对转基因杨树与野生型杨树相对含水量的影响  93-94
        3.2.3 转基因杨树与野生型植株中Na~+、K~+ 含量及K~+/Na~+ 比的变化情况  94
        3.2.4 盐处理对转基因杨树与野生型杨树叶片光合的影响  94-95
        3.2.5 盐处理对转基因杨树与野生型杨树中丙二醛(MDA)的影响  95-96
        3.2.6 NaCl 处理对转基因杨树细胞膜透性的影响  96-97
        3.2.7 转基因杨树与野生型对照组织中脯氨酸含量的变化  97
    4 讨论  97-99
参考文献  99-115
附录  115-118
缩写词  118-120
攻读博士学位期间的学术论文、获奖成果、著作及参与的科研课题  120-121
致谢  121-122
图版  122

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学
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