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溶栓酶基因的克隆及表达

作　者: 肖璐
导　师: 张义正
学　校: 四川大学
专　业: 遗传学
关键词: 解淀粉芽孢杆菌豆豉溶栓酶藤黄微球菌藤黄微球菌溶栓酶淀粉酶基因枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因基因克隆基因表达
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

通过纤维蛋白平板筛选、纤溶活性测定和体外溶栓分析相结合的方法,成功地从环境中筛选到一株纤溶活性较高的细菌菌株。利用细菌分类鉴定方法对其形态和生理生化特征进行了研究,发现其与藤黄微球菌的特征相符。根据细菌16S rDNA的保守序列设计1对引物,采用PCR技术扩增出该菌的16S rDNA片段,对该序列克隆后测序,并与已报道的序列进行比对,结果表明:它与藤黄微球菌的16S rDNA序列的同源性高达99%。此结果进一步表明,该菌在系统分类学上属于微球菌属(Micrococcus Cohn)藤黄微球菌(Micrococcus luteus),将其命名为ML-909。根据解淀粉芽孢杆菌的豆豉溶栓酶(DFE)全基因、前肽-成熟肽(proDFE)序列、成熟肽编码序列设计3对引物,以ML-909菌株的总DNA为模板进行PCR扩增,扩增结果表明,从ML-909 DNA中扩增出编码成熟肽的DNA片段。测序结果显示,该片段大小为828bp,与豆豉溶栓酶(DFE)成熟肽基因片段大小完全相同,同源性达到99%,仅有2个碱基的差异,并导致1个氨基酸的变异。该序列编码由275个氨基酸残基组成的酶蛋白,命名为藤黄微球菌溶栓酶(MLFE)。为了进一步探讨溶栓酶基因的异源表达特性,根据豆豉溶栓酶基因前肽-成熟肽的N-端和C-端编码序列分别设计2对引物,并在引物N-端和C-端分别引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ识别序列,分别以解淀粉芽孢杆菌及藤黄微球菌基因组DNA为模板,扩增出豆豉溶栓酶的前肽.成熟肽序列(1059bp)和MLFE成熟肽编码区(828bp)。扩增产物克隆到pMD18-T载体中,所获重组质粒经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,将其克隆到大肠杆菌高效表达质粒pMAL-p2X中,构建溶栓酶基因-麦芽糖结合蛋白基因相融合的表达质粒pMAL-pDFE及

全文目录

中文摘要  11-14
英文摘要  14-17
前言  17-20
第一章溶栓酶的产生菌筛选、鉴定及其基因克隆  20-43
  摘要  21-22
  1 引言  22-23
  2 材料和方法  23-31
    2.1 材料  23
    2.2 实验方法  23-31
  3 结果  31-37
    3.1 溶栓酶产生菌ML-909的表型和生化鉴定  31
    3.2 溶栓酶产生菌ML-909的分子鉴定  31-34
    3.3 溶栓酶基因的克隆与序列分析  34-36
    3.4 MLFE与其它蛋白酶基因的比较  36
    3.5 ML-909纤溶酶活性的检测  36-37
  4 讨论  37-40
    4.1 纤溶酶产生菌的筛选方法  37
    4.2 纤溶酶基因的同源性  37-38
    4.3 MLFE基因的结构  38-39
    4.4 MLFE蛋白质结构的预测  39-40
  小结  40
  参考文献  40-43
第二章溶栓酶基因在大肠杆菌中的表达  43-62
  摘要  44-45
  1 引言  45-46
  2 材料和方法  46-53
    2.1 材料  46-48
    2.2 实验方法  48-53
  3 结果  53-58
    3.1 表达质粒的构建策略  53-54
    3.2 proDFE和MLFE的PCR扩增  54-55
    3.3 proDFE和MLFE基因的克隆及重组子的鉴定  55-56
    3.4 proDFE和MLFE表达质粒的构建  56-57
    3.5 转化细胞的培养及融合蛋白的诱导表达  57
    3.6 融合蛋白的纯化  57-58
    3.7 表达蛋白的溶栓酶活性检测  58
  4 讨论  58-60
    4.1 溶栓酶基因在大肠杆菌中的表达  58-59
    4.2 豆豉溶栓酶基因在大肠杆菌中与MBP基因融合表达的分析  59
    4.3 在大肠杆菌中表达有活性豆豉溶栓酶的展望  59-60
  小结  60
  参考文献  60-62
第三章溶栓酶基因在枯草杆菌中的组成型表达  62-98
  摘要  63-64
  1 引言  64-66
  2 材料和方法  66-73
    2.1 材料  66-68
    2.2 实验方法  68-73
  3 结果  73-89
    3.1 溶栓酶基因枯草杆菌组成型表达载体的构建策略  73-76
    3.2 解淀粉芽孢杆菌DC-4α-淀粉酶基因启动子-信号肽编码区的克隆与序列分析  76-78
    3.3 溶栓酶基因表达质粒的构建与鉴定  78-80
    3.4 重组溶栓酶基因在枯草杆菌中的表达  80-83
    3.5 DFE基因工程菌WB-DFE5(WB600／pSU-AmyDFE)发酵条件的研究  83-87
    3.6 溶栓酶(DFE)基因表达产物(rDFE)的纯化  87-89
  4 讨论  89-93
    4.1 解淀粉芽孢杆菌DC-4α-淀粉酶启动子-信号肽序列的分析  89-90
    4.2 溶栓酶基因前肽的作用  90-91
    4.3 不同溶栓酶基因在枯草杆菌中表达产物的活性比较  91
    4.4 表达宿主菌的选择  91-92
    4.5 rDFE的纯化  92-93
    4.6 融合基因构建的策略  93
  小结  93-94
  参考文献  94-98
第四章豆豉溶栓酶基因在枯草杆菌WB600中的诱导表达  98-119
  摘要  99-100
  1 引言  100-101
  2 材料和方法  101-106
    2.1 材料  101-102
    2.2 实验方法  102-106
  3 结果  106-112
    3.1 豆豉溶栓酶基因蔗糖诱导表达载体构建策略  106-107
    3.2 果聚糖蔗糖酶基因启动子-信号肽序列(sacR)的克隆和序列分析  107-108
    3.3 豆豉溶栓酶融合基因(SacDFE)的构建  108-110
    3.4 重组表达质粒pSU-SacDFE的构建与鉴定  110
    3.5 重组质粒pSU-SacDFE在WB600中的诱导表达  110
    3.6 枯草杆菌感受态细胞转化方法的改进  110-111
    3.7 融合基因SacDFF表达产物的SDS-PAGE分析  111
    3.8 不同诱导时间对基因表达的影响  111-112
  4 讨论  112-115
    4.1 sacR对豆豉溶栓酶基因表达调控的分析  112-113
    4.2 提高豆豉溶栓酶基因表达的策略  113-114
    4.3 枯草杆菌转化方法的比较  114-115
  小结  115
  参考文献  115-119
文献综述  119-172
  摘要  120-121
  Ⅰ 蛋白酶表达系统的研究进展  121-149
    1 原核表达系统  121-134
      1.1 大肠杆菌表达系统  121-128
      1.2 枯草杆菌表达系统  128-131
      1.3 其它原核表达系统  131-134
    2 真核表达系统  134-147
      2.1 酵母表达系统  135-143
      2.2 昆虫细胞表达系统  143-147
    3 其他的真核表达系统  147-149
      3.1 木霉表达系统  147-148
      3.2 丝状真菌表达系统  148-149
  Ⅱ 蛋白酶基因的体外定向进化研究进展  149-158
    1 酶基因的定点突变  150-151
    2 随机诱变  151-153
      2.1 通过易错PCR(error-prone PCR)产生随机突变  151-152
      2.2 化学诱变剂介导的随机诱变  152
      2.3 由致突变菌株(mutator strain)产生随机突变  152-153
    3 基因体外重组  153-157
      3.1 限制性酶切再连接介导的基因重组  153
      3.2 DNA改组  153-155
      3.3 交错延伸技术  155-156
      3.4 临时模板随机嵌合技术  156-157
      3.5 SCRATCH技术  157
    4 筛选  157-158
  参考文献  158-172
致谢  172-173
在读期间发表或被接受的论文  173-174
声明  174

溶栓酶基因的克隆及表达

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