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用于有机相中催化反应的脂肪酶固定化

作　者: 崔娟
导　师: 杨立荣；吴坚平
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 脂肪酶固定化 1-苯乙醇转酯化手性拆分
分类号: O643.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 472次
引　用: 3次
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内容摘要

本文首先综述了目前手性化合物的研究成果，介绍了固定化酶的定义、制备方法、固定化对酶的活性影响及固定化酶的应用情况。在实际应用中，利用游离酶作为催化剂有很多的局限性，因此本文主要研究Lipase QL的固定化。Lipase QL能够高选择性地催化R-1-苯乙醇的转酯化反应，因此以(R，S)-1-苯乙醇的拆分反应作为模型反应，考查固定化酶的效果。乙酸乙烯酯作为酰基供体兼溶剂，在有机相中1-苯乙醇与乙酸乙烯酯在脂肪酶的催化下发生不可逆的转酯化反应。具体反应方程式如下：经过对两种固定化方法、四种载体的固定化效果的比较，选择载体涂布法为酶固定化方法，硅藻上为固定化载体。考察了固定化过程中各种影响因素对固定化酶转酯活力的影响。确定较佳的固定化条件为缓冲液pH9.2，浓度0.03mol／l，载体∶酶=5∶1，得到的固定化酶具有较高的转酯活力，为含相同蛋白量游离酶转酯活力的14.3倍，酶的回收率为89％。考察了固定化酶催化转酯化反应的条件，并与游离酶进行比较。选用40℃，150rpm进行反应，固定化酶在1—苯乙醇浓度为3.0mol／L左右出现底物抑制现象；考察了含相同蛋白量的固定化酶和游离酶催化转酯化反应的全过程，当转化率达到50％时，前者所用的时间比后者缩短了5倍。固定化没有改变酶的底物选择性，反应中R—乙酸-1-苯乙醇酯的对映体选择性在98％以上。考察了固定化酶的性质。固定化酶较游离酶有更好的热稳定性；将固定化酶用于催化转酯化反应的全过程，重复使用10次，酶活还保留有75.5％，操作稳定性较好；将固定化酶分别在4℃、30℃、40℃下放置56天，保留的活力分别是原来的70.4％、56％和45.7％，在4℃下贮存稳定性较好。考察了另一种对R-1-苯乙醇具有高选择性的酶Lipase AS的固定化情况。利浙江大学硕士学位论文摘要用载体涂布法，硅藻土作载体，在缓冲液pH为8.5，浓度为0.05mol/1，载体:酶二13:1时得到的固定化酶具有较高的转酷活力。对固定化酶的热稳定性、重复利用情况的考查中，发现其在有机溶剂中失活严重。固定化酶的底物耐受能力较游离酶低。建立了固定化酶催化转醋化拆分1一苯乙醇反应的动力学模型。V==K，[B]*[凡] K，+K:[B]*+K卵[Q]R+K。创[B]R[Q]R 根据实验数据，进行参数拟合，得到一组模型参数为: KP一0 .0003min一l、KA=o.95sgnunol几、KB一o.oo54mmol/L、KQ后o.000oZmmo一几、 KBQA=0.000011刃以们匡0拢将不同浓度、不同酶量下的模型计算值与实验值进行比较，二者基本吻合，结果表明该模型能较好的反映实际情况。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章文献综述  11-31
  1.1 酶与手性技术  11-14
    1.1.1 手性技术的研究意义及重要性  11-12
    1.1.2 手性化合物的制备  12
    1.1.3 生物法(酶法)制备手性化合物  12-13
    1.1.4 酶在手性技术上的应用  13-14
  1.2 酶的修饰及固定化  14-22
    1.2.1 游离酶应用上的缺点  14-15
    1.2.2 酶的修饰  15
    1.2.3 固定化酶  15-22
      (1) 固定化酶的方法  16-19
      (2) 固定化酶的性质  19-21
      (3) 固定化酶活性的影响因素  21-22
      (4) 固定化酶的应用  22
  1.3 脂肪酶的固定化方法及研究进展  22-26
    1.3.1 脂肪酶概述  22-23
    1.3.2 脂肪酶的固定化方法  23-26
  1.4 脂肪酶催化转酯化反应的动力学  26-29
    1.4.1 脂肪酶催化转酯反应的机理  26-27
    1.4.2 影响固定化酶动力学的性态和参数  27-29
  1.5 本文思路  29-31
第二章实验材料与方法  31-39
  2.1 实验材料  31-32
    2.1.1 实验仪器  31
    2.1.2 实验药品  31-32
  2.2 实验方法  32-39
    2.2.1 酯标准品的制备  32
    2.2.2 载体的活化方法  32-33
    2.2.3 酶水解活力的测定  33-35
    2.2.4 酶转酯活力的测定及酶催化选择性的计算  35-37
    2.2.5 蛋白含量测定  37-38
    2.2.6 酶的固定化方法  38-39
第三章 Lipase QL的固定化  39-57
  3.1 固定化载体、固定化方法的选择  39-40
  3.2 载体活化方法对酶固定化的影响  40-42
  3.3 载体涂布法固定化酶  42-44
    3.3.1 载体与酶粉比例对酶固定化的影响  42-43
    3.3.2 缓冲液pH的影响  43
    3.3.3 缓冲液浓度的影响  43-44
  3.4 固定化酶催化转酯化反应拆分1-苯乙醇  44-48
    3.4.1 温度的影响  44-45
    3.4.2 固定化酶的热稳定性  45-46
    3.4.3 转速的影响  46
    3.4.4 底物浓度的影响  46-47
    3.4.5 固定化酶与游离酶催化转酯化反应过程  47-48
  3.5 固定化酶的性质  48-52
    3.5.1 固定化酶的水解活力  48-49
      (1) 不同缓冲液pH下的水解活力  48
      (2) 不同温度下的水解活力  48-49
    3.5.2 固定化酶失活考察  49-50
    3.5.3 重复利用情况  50-51
    3.5.4 固定化酶的贮存稳定性考察  51-52
  3.6 酶的转酯化反应过程  52-55
    3.6.1 游离酶的转酯反应过程  52-53
    3.6.2 固定化酶的转酯反应过程  53-55
  3.7 本章小结  55-57
第四章 Lipase AS的固定化  57-64
  4.1 载体涂布法固定化酶  57-59
    4.1.1 载体:酶对酶固定化的影响  57-58
    4.1.2 缓冲液pH的影响  58
    4.1.3 缓冲液浓度的影响  58-59
  4.2 固定化酶的性质  59-63
    4.2.1 固定化酶催化转酯化反应过程  59-60
    4.2.2 固定化酶的热稳定性  60
    4.2.3 底物浓度的抑制情况  60-61
    4.2.4 固定化酶的重复利用情况  61-62
    4.2.5 固定化酶的失活考察  62-63
  4.3 本章小结  63-64
第五章固定化酶动力学研究  64-74
  5.1 引言  64-65
  5.2 反应机理  65-67
  5.3 模型的推导  67-70
  5.4 模型参数的拟合  70-73
    5.4.1 参数拟和的方法  70
    5.4.2 拟合参数及模型结果  70-73
  5.5 本章小结  73-74
第六章结论与建议  74-76
  6.1 结论  74-75
  6.2 建议  75-76
参考文献  76-81
附录  81-83
致谢  83

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