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猪主要致病链球菌多重PCR诊断方法的建立及流行病学调查应用

作　者: 邹君
导　师: 曾巧英；范伟兴
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 链球菌猪链球菌马链球菌兽疫亚种多重PCR 血清凝集试验 MLST
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

链球菌种型众多,但致病性差异显著,本研究针对猪的主要致病种和型(C群马链球菌兽疫亚种Streptococcus equi subsp . zooepidemicus和猪链球菌1、2、7、9型Streptococcus suis,SS1、SS2、SS7、SS9),在属、种、型三个水平上建立了一次性诊断链球菌的多重PCR诊断方法;并应用初步建立的多重PCR方法,结合本实验室在流行病学调查时使用的单纯PCR分型方法、血清学分型方法和MLST分型方法,对中国部分地区猪链球菌的流行病学进行调查分析。研究结果如下:(1)猪主要致病链球菌多重PCR诊断方法的建立:根据GenBank已登录序列,针对链球菌属保守基因(延伸因子EF-TU)、SS种保守基因(谷氨酸脱氢酶,GDH)、马链球菌兽疫亚种保守基因(类M蛋白,M-like)、SS型特异性基因(荚膜多糖,SS1型CPS1I、SS2型CPS2J、SS7型CPS7H和SS9型CPS9H)设计合成7对引物,预计扩增片段大小分别为:197、943、1137、441、291、541、388bp;制备混合模板(SS1、SS2、SS7、SS9和Streptococcus equi subsp . zooepidemicus),建立多重PCR方法。设B群无乳链球菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和水为对照进行特异性试验。用SS1、SS2、SS7、SS9标准株及Streptococcus equi subsp . zooepidemicus猪源555株进行准确性试验;并对16株链球菌临床分离鉴定菌进行验证性检测。梯度稀释混合模板进行敏感性试验。分别制备混合模板进行5次重复性试验。结果表明,建立的多重PCR方法在退火温度为61℃时可一次性扩出7条符合预期大小、序列正确的基因条带。特异性试验和准确性试验结果均符合预期,无非特异性、交叉反应、假阳性、假阴性条带出现,对16株临床分离鉴定链球菌的验证检测结果和细菌学鉴定及单纯PCR鉴定的符合率为100%。敏感性为0.08ng/μL;5次重复试验结果一致。结果提示,本研究建立的多重PCR方法,是截至目前唯一能够一次性在属、种、型三个水平上同时诊断猪主要致病链球菌的PCR诊断方法,具有高度特异性、准确性、敏感性和稳定性,高效、经济、快速是其优势,适用于猪场链球菌病监控和流行病学快速诊断。(2)流行病学调查:对2010年6个省份屠宰场的900份扁桃体或淋巴结样品进行细菌分离培养,然后用GDH、CPS1I、CPS2J、CPS7H、CPS9G基因序列PCR鉴定种型,并用血清凝集试验复检,共检出28株猪链球菌(检出率为3.11%);其中3株为SS2,2株SS7,1株SS9,2株SS3,1株SS15,1株SS19,1株SS27,1株SS34;最后用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)系统研究各菌株之间的遗传关系,在13株能够定型的猪链球菌中,3株ST1,2株ST29,2株ST168,ST27、ST28、ST45、ST117、ST163和ST174各1株,两株申报ST新型;部分菌株的7个管家基因(aroA、Cpn60、Dpr、Gki、Muts、RecA、ThrA)中的某些基因的PCR扩增产物呈阴性或不能准确测序,导致无法从MLST数据库中比对出相应的ST型。

全文目录

摘要  2-4
Summary  4-6
缩略语  6-10
第一篇文献综述  10-21
  第一章猪链球菌病概述  10-15
    1 病原学  10-11
    2 流行病学  11
    3 临床症状  11-12
    4 病理变化  12
    5 诊断  12-13
      5.1 显微镜检查  12
      5.2 分离培养  12-13
      5.3 动物接种  13
      5.4 分子生物学方法鉴定  13
    6 防治  13
      6.1 预防  13
      6.2 药物治疗  13
    7 小结  13-15
  第二章猪链球菌诊断分型鉴定技术的研究进展  15-21
    1 传统分型方法  15-17
      1.1 培养及形态学检查  15
      1.2 生化试验鉴定  15-16
      1.3 血清学试验  16-17
    2 分子生物学方法  17-21
      2.1 聚合酶链式反应  17-18
      2.2 16S rRNA 基因对猪链球菌进行定型  18
      2.3 利用分子伴侣（Cpn60）基因对猪链球菌进行基因分群  18
      2.4 多位点序列分型技术  18
      2.5 多位点酶电泳分型技术  18-19
      2.6 限制性内切酶图谱分析分型技术  19
      2.7 随机扩增DNA 片段多态性分析分型技术  19
      2.8 脉冲凝胶电泳  19
      2.9 核糖体分型技术  19-20
      2.10 基因芯片技术检测猪链球菌  20
      2.11 PCR-RFLP 方法  20-21
第二篇试验部分  21-43
  第一章猪主要致病链球菌多重 PCR 诊断方法的建立  21-28
    1 材料和方法  21-23
      1.1 菌株  21
      1.2 细菌培养  21
      1.3 模板制备  21
      1.4 引物设计与合成  21
      1.5 多重PCR 反应条件确定  21-22
      1.6 特异性试验  22
      1.7 准确性试验  22
      1.8 敏感性试验  22-23
      1.9 重复性试验  23
    2 结果  23-26
      2.1 多重PCR 反应条件确定  23-24
      2.2 特异性试验  24
      2.3 准确性试验  24-25
      2.4 敏感性试验  25-26
      2.5 重复性试验  26
    3 讨论  26-28
  第二章 2010 年中国部分地区猪链球菌的流行病学调查  28-43
    1 材料与方法  28-32
      1.1 菌株与抗血清  28
      1.2 试剂、引物与培养基  28
      1.3 样品采集  28
      1.4 细菌分离培养  28
      1.5 模板的制备  28-30
      1.6 PCR 鉴定  30-32
        1.6.1 引物  30-31
        1.6.2 gdh PCR 反应体系及条件  31
        1.6.3 1、2、7、9 型分型PCR 反应体系及条件  31
        1.6.4 毒力因子PCR 反应体系及条件  31-32
        1.6.5 MLST（多位点序列分型）PCR 反应体系及条件  32
    2 结果  32-41
      2.1 猪链球菌分布情况  32-33
      2.2 PCR 鉴定结果  33-35
        2.2.1 gdh 鉴定  33-34
        2.2.2 1、2、7、9 型PCR 分型鉴定  34-35
        2.2.3 多重PCR 分型鉴定  35
      2.3 血清学检测  35-37
      2.4 毒力因子PCR 检测结果  37-38
      2.5 MLST 分型结果  38-41
    3 讨论  41-43
参考文献  43-49
全文总结  49-50
致谢  50-51
作者简介  51-52
导师简介  52-54

猪主要致病链球菌多重PCR诊断方法的建立及流行病学调查应用

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