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无抗性标记表达纤维素酶的罗伊乳杆菌重组菌的构建

作　者: 孙琳
导　师: 陈玉林
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 纤维素酶罗伊乳杆菌抗性标记基因整合载体同源重组重组菌
分类号: S816
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

把高活性的外源纤维素酶基因,通过构建的克隆、表达载体电转入乳酸杆菌宿主内,并将其定植于畜禽胃肠道,评估其对纤维素、半纤维素利用效率的作用,建立携带纤维素酶基因的乳酸杆菌益生素生产技术体系是具有创新性的提高动物粗饲料利用率提供基础。目前,遇到的主要技术难点是如何提高整合载体的表达效率,同时获得定植所需的不携带抗性标记基因的高效表达重组乳酸杆菌。针对这些实际问题,本研究将试图解决既有整合表达载体的抗性标记基因的有效删除方法与技术,从而建立无抗性标记基因的纤维素酶乳酸杆菌载体表达系统。主要研究结果如下:1.采用基因克隆等分子生物学技术构建了包含纤维素酶基因表达盒Cel15 cassette和Loxp片段的整合表达载体pG-HAF-HAR-C15cassette-loxp Cm。2.采用醋酸锂（LiAc）和二硫苏糖醇（DTT）预处理罗伊乳酸杆菌细胞,优化了LiAc和DTT的处理时间及电击前细胞的浓度。获得的电转化效率为32.6±7.2×10⁷个转化子/μg DNA,比未经处理的细胞转化效率高了10⁵倍;转化效率随细胞密度的升高而提高,在细胞浓度为10¹⁰时达到最高;验证了该方法具有重复性和高效性。3.通过优化的转化方法,将整合载体转化并整合到了鸡源野生型乳酸杆菌（Lactobacillus reuteri XNY）基因组中,并通过Cre-Loxp系统成功删除了氯霉素抗性基因,获得一株无抗性标记的纤维素酶整合乳酸杆菌L-S2。且初步测定数据表明,该重组乳酸杆菌改良培养基发酵液的纤维素酶活力为0.426 U/mL。综上所述,本研究构建了无抗性整合型乳酸杆菌工程菌表达系统,并测定了纤维素酶的表达水平,为进一步探讨该工程菌在家畜消化道内的定植及其对生长性能和饲料粗纤维消化率的影响奠定了基础。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
第一章文献综述  10-23
  1.1 纤维素酶的研究进展  10-14
    1.1.1 纤维素酶的结构与功能  10-11
    1.1.2 纤维素酶的应用  11-13
    1.1.3 纤维素酶基因工程研究进展  13-14
  1.2 乳酸杆菌研究进展  14-19
    1.2.1 乳酸杆菌简介  14-15
    1.2.2 乳酸杆菌基因工程菌的研究进展  15-18
    1.2.3 乳酸杆菌的应用  18-19
  1.3 DNA 同源重组与Cre-loxp 系统  19-22
    1.3.1 同源重组简介  20
    1.3.2 Cre/Loxp 系统  20-22
  1.4 本研究的目的及意义  22-23
第二章乳酸杆菌整合载体的构建  23-35
  2.1 材料与方法  23-27
    2.1.1 材料  23-24
    2.1.2 方法  24-27
  2.2 结果与分析  27-33
    2.2.1 载体pG-HAF 的构建  27-29
    2.2.2 质粒pG-HAF-HAR 的构建  29-30
    2.2.3 纤维素酶基因表达盒C15 cassette 的构建  30-32
    2.2.4 质粒pG-HAF-HAR-C15cassette 的构建  32
    2.2.5 质粒pG-HAF-HAR-C15cassette-loxp Cm 的构建  32-33
  2.3 讨论  33-34
    2.3.1 整合载体构建  33-34
    2.3.2 同源序列的克隆  34
    2.3.3 启动子的筛选  34
  2.4 小结  34-35
第三章乳酸杆菌电转化效率的优化  35-40
  3.1 材料与方法  35-37
    3.1.1 菌种和质粒  35
    3.1.2 引物设计  35
    3.1.3 主要仪器和试剂  35-36
    3.1.4 主要试剂配制  36
    3.1.5 质粒DNA 的准备  36
    3.1.6 转化效率的计算  36
    3.1.7 乳酸杆菌电转化  36
    3.1.8 转化效率的质量鉴定  36-37
    3.1.9 数据分析  37
  3.2 结果与分析  37-38
    3.2.1 LiAc 和DTT 不同处理时间对罗伊乳杆菌转化效率的影响  37
    3.2.2 不同菌体浓度的转化效率  37-38
    3.2.3 质粒稳定性鉴定  38
  3.3 讨论  38-39
  3.4 小结  39-40
第四章载体整合以及纤维素酶基因的表达  40-48
  4.1 材料与方法  40-42
    4.1.1 材料  40-41
    4.1.2 方法  41-42
  4.2 结果与分析  42-46
    4.2.1 纤维素酶基因表达盒在乳酸杆菌基因组的整合  42-43
    4.2.2 抗性基因Cm~r 的删除  43-44
    4.2.3 整合乳酸杆菌菌株L-S2 纤维素酶活性分析  44-46
  4.3 讨论  46
    4.3.1 无抗性整合乳酸杆菌的检测  46
    4.3.2 表达产物的检测  46
  4.4 小结  46-48
第五章结论  48-49
  5.1 研究结论  48
  5.2 本研究创新点  48
  5.3 还需深入研究的内容  48-49
参考文献  49-55
附录  55-59
缩略词  59-60
致谢  60-61
作者简介  61

无抗性标记表达纤维素酶的罗伊乳杆菌重组菌的构建

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