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葡萄球菌肠毒素B(SEB)中和抗体的协同作用及其分子机制

作　者: 李永明
导　师: 金伯泉；杨琨
学　校: 第四军医大学
专　业: 免疫学
关键词: 超抗原葡萄球菌肠毒素中和抗体协同作用表位
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景:葡萄球菌肠毒素B(SEB)是一种超抗原,通过结合T细胞上特定的TCR Vβ区和MHC-Ⅱ类分子,活化T细胞使其释放一系列的细胞因子,主要包括IFN-γ和TNF-α等,引起机体发生毒性休克综合征(TSS)甚至死亡。SEB是一种潜在的生物武器,致死剂量在ng/kg体重左右。目前对毒素类物质中毒的治疗主要用中和抗体,如肉毒毒素抗血清在临床上用来治疗肉毒毒素中毒,静脉注射人丙种球蛋白(IVIG)用来治疗SEB中毒。在针对肉毒毒素和破伤风毒素的导克隆抗体(mAb)中和作用的研究中,均提示识级不同表位的mAbs组合有很强的协同作用。所以混合导克隆抗体可能是替代抗血清、提高疗效并实现人源化的一种新途径。组合抗体发挥协同作用的机制与其组合后亲和力的提高和抗体对毒素覆盖面积的增大有关,但确切的机制目前还不完全清楚。目的:制备针对SEB的mAbs并筛选具有协同作用的组合抗体,通过体内外实验评价其中和作用,精确鉴定mAbs识级的表位和测定mAbs的亲和力,研究不同表位在毒素分子表面的分布规律以及对毒素构象和功能产生的影响。方法和结果:用常规方法制备了22株特异性强、效价高的抗SEB mAbs,以任意3株mAbs为一组等量混合,观察其对SEB刺激T细胞产生的增殖效应的抑制作用,筛选出中和活性最强的一组mAbs,由mAbs FMU-SEB-1,2和10组成,并通过体内实验对其中和作用进行了证实。通过对SEB分子上参与TCR和MHC-Ⅱ类分子结合的氨基酸进行定点突变,并且表达由SEB/SEC1构成的一系列杂合分子,鉴定3株抗体识级的表位: FMU-SEB-1识级的表位由138和143位的氨基酸组成,该区域与SEB-TCR、SEB-MHC-Ⅱ类分子相互作用的部位距离较远,提示可能与改变SEB的构象有关系; FMU-SEB-2识级的表位由55、56、61、81和88位氨基酸组成,覆盖SEB-TCR相互结合的区域; FMU-SEB-10识级的表位由91和177位氨基酸组成,这2个aa位于SEB-TCR结合位点的边缘,其中91位aa靠近SEB-MHCⅡ类分子的结合位置。FMU-SEB-10在功能上可以同时抑制SEB-TCR以及SEB-MHC-Ⅱ类分子的结合。结论:鉴定了一组具有显著协同作用的SEB中和抗体表位的分布规律,分析了毒素分子结构、抗体表位位置、亲和力和抗体中和作用之时的关系。为研制SEB中毒新型治疗制剂和阐明SEB超抗原作用的分子机制提供重要依据。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
前言  13-14
文献回顾  14-32
  1 超抗原的概念、种类和葡萄球菌肠毒素  14-15
  2 SAG 的功能和致病性  15-24
  3 毒素类物质引起的中毒和治疗  24-32
实验一 SEB 导克隆抗体的制备、鉴定和筛选  32-39
  1 材料  32-33
  2 方法  33-36
  3 结果  36-38
  4 讨论  38-39
实验二体内外实验评价SEB 抗体的中和作用和协同作用  39-43
  1 材料  39
  2 方法  39-40
  3 结果  40-42
  4 讨论  42-43
实验三夹心和竞争ELISA 分析SEB 中和抗体识级的表位  43-47
  1 材料  43
  2 方法  43-45
  3 结果  45-46
  4 讨论  46-47
实验四 SEB 中和抗体对SEB-TCR 和SEB-HLA-DR1 结合的阻断作用  47-52
  1 材料  47-48
  2 方法  48-50
  3 结果  50-51
  4 讨论  51-52
实验五截短和定点突变的方法确定SEB 中和抗体识级的表位  52-68
  1 材料  52
  2 方法  52-58
  3 结果  58-66
  4 讨论  66-68
实验六中和抗体识级的表位在SEB 晶体结构上的分布以及与功能的关系  68-72
  1 材料  68-69
  2 方法  69-70
  3 结果和讨论  70-72
实验七 SEB 中和抗体亲和力的测定  72-75
  1 材料  72
  2 方法  72-74
  3 结果  74
  4 讨论  74-75
小结  75-76
参考文献  76-89
个人简历和研究成果  89-92
致谢  92

葡萄球菌肠毒素B(SEB)中和抗体的协同作用及其分子机制

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