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IRES调控α-干扰素的抗FMDV研究

作　者: 熊义
导　师: 郑从义
学　校: 武汉大学
专　业: 微生物
关键词: 口蹄疫病毒(FMDV) IRES α-干扰素(IFN-α) RNA干扰 miRNA
分类号: S855.3
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是一种在全球范围内广泛传播的烈性传染病,主要感染偶蹄类动物。口蹄疫的爆发对畜牧业生产危害极大,被国际兽疫局(OIE)列为A类家畜传染病之首。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus, FMDV)是口蹄疫的病原体,属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属,为单股正链RNA病毒,基因组全长约为8500个核苷酸。和其他RNA病毒一样,FMDV基因组的多变性给对其防治带来了很大困难。因此,如何研发有效的预防和治疗FMDV感染的药物是当务之急。α-干扰素是一种广谱抗病毒药物,对FMDV的感染有一定的抑制作用。但由于FMDV能够通过阻断宿主帽子结构依赖的蛋白翻译机制来抑制α-干扰素的表达,使得通过细胞内表达α-干扰素来抗FMDV感染的效果差强人意。为了克服FMDV的这种作用机制,增强α-干扰素的抗病毒效率,本研究通过直接PCR的方法,从猪肝组织基因组中克隆了含有信号肽序列的α-干扰素基因,将其连接从FMDV克隆的IRES序列的3’端,构建了α-干扰素表达重组质粒p-IRES-IFN,使α-干扰素在细胞内的表达受到IRES的调控。同时将α-干扰素基因连接到功能完全丧失的IRES突变体的3’端,构建了一系列对照重组质粒：pc-IRES△G-IFN、pc-IRES△T-IFN,使α-干扰素在细胞内的表达受到突变的IRES的调控。将以上重组质粒转染PK细胞后发现,未感染病毒条件下,α-干扰素能够表达,受IRES的影响不大。当转染α-干扰素表达重组质粒的PK细胞被0.1 pfu/cell的水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)感染12小时后,除了转染pc-IRES-IFN的细胞中α-干扰素表达水平降低外,其他均有所增强；而在感染24小时后,所有细胞的α-干扰素表达水平都超过了感染前的水平。这说明VSV的感染不仅不能抑制内源或者外源α-干扰素基因的表达,而且会刺激内源α-干扰素基因的表达。源于FMDV的IRES在VSV感染时,对α-干扰素的表达基本没有影响。当转染α-干扰素表达重组质粒的PK细胞受到0.1 pfu/cell的FMDV感染后,受突变的IRES调控的到α-干扰素基因的表达受到抑制：在感染12小时后,表达量仅为感染前的70%左右；感染24小时后,表达量继续下降到感染前的50%左右。而受野生型FMDV IRES调控的α-干扰素基因在感染12小时后,表达量为感染前的90%左右；感染24小时后,表达量增加到感染前的125%左右。研究结果表明在IRES的调控下,α-干扰素能够克服宿主翻译抑制且持续表达。同时,通过荧光定量RT-PCR技术检测结果显示：PK细胞转染重组质粒p-IRES-IFN后,FMDV在其中的复制水平只有正常PK细胞中的复制水平的2%；PK细胞转染重组质粒pc-IRES△G-IFN和pc-IRES△T-IFN后,FMDV在其中的复制水平只有正常PK细胞中的复制水平的10%；这说明外源表达a-干扰素能够抑制FMDV的复制,IRES的调控能够增强α-干扰素的抗病毒效果。此外,噬斑试验也证实了上述结果。RNAi技术被广泛的用于抗病毒感染。以mir-30为模型,通过软件设计出潜在的能够使FMDV 3D基因沉默的特异性miRNA序列,并以pcDNA3.1(+)质粒为载体构建能够表达成熟miRNA的重组质粒p3D-1250。将p3D-1250转染BHK-21细胞,并筛选出稳定细胞系,通过感染FMDV研究miRNA对FMDV复制的干扰作用。蚀斑试验结果表明特异性miRNA可以抑制FMDV的复制,实时荧光定量RT-PCR检测数据显示特异性miRNA抑制FMDV的效率达50%,可见设计的特异性miRNA能够成功干扰FMDV的复制。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
第一章前言  14-61
  1.1 口蹄疫病毒简介  14-29
    1.1.1 FMDV基因组RNA 5’-UTR  15-19
      1.1.1.1 FMDV基因组的蛋白帽结构  15-16
      1.1.1.2 S片段、Poly(C)区段、假结(PKs)和复制顺式作用元件结构  16-17
      1.1.1.3 内部核糖体进入位点(IRES)  17-19
    1.1.2 L蛋白(Leader protein)  19
    1.1.3 结构蛋白区  19-20
    1.1.4 非结构蛋白  20-22
      1.1.4.1 2A/B/C蛋白  20-21
      1.1.4.2 3A/B蛋白  21
      1.1.4.3 3C~(pro)蛋白  21
      1.1.4.4 3D~(pro)蛋白  21-22
    1.1.5 FMDV基因组RNA 3’-UTR  22
    1.1.6 FMDV逃避宿主免疫系统的研究  22-29
      1.1.6.1 L~(pro)病毒相关因子,能够阻断宿主免疫反应  22-24
      1.1.6.2 3C~(pro)对转录机制的影响  24
      1.1.6.3 FMDV能够逃逸树突状细胞的保护反应  24-25
      1.1.6.4 FMDV影响蛋白分泌途径和MHC class Ⅰ的递呈  25-26
      1.1.6.5 FMDV感染导致淋巴细胞减少症  26-27
      1.1.6.6 FMDV感染期间的细胞死亡  27-29
  1.2 α-干扰素的简介和研究进展  29-44
    1.2.1 干扰素的发现及分类  29
    1.2.2 干扰素的基因  29-30
    1.2.3 干扰素的产生  30-31
    1.2.4 干扰素的生物学活性及作用  31-36
      1.2.4.1 干扰素的抗病毒活性  32-33
      1.2.4.2 抗细胞增殖活性  33-34
      1.2.4.3 干扰素的免疫调节活性  34-35
      1.2.4.4 干扰素的抗肿瘤作用  35-36
      1.2.4.5 干扰素的其他作用  36
    1.2.5 干扰素的作用特点  36
    1.2.6 干扰素的作用机理  36-42
      1.2.6.1 干扰素的信号传递途径  36-38
      1.2.6.2 干扰素信号的调节  38-40
      1.2.6.3 干扰素的抗病毒机理  40-42
        1.2.6.3.1 PKR系统的抗病毒原理  41
        1.2.6.3.2 OAS系统的抗病毒原理  41-42
        1.2.6.3.3 Mx系统的抗病毒原理  42
    1.2.7 干扰素的临床应用  42-44
  1.3 RNAi及其在抗病毒中的应用  44-60
    1.3.1 RNAi的发现  44-46
    1.3.2 RNAi的作用机理  46-48
      1.3.2.1 dsRNA的产生  46
      1.3.2.2 dsRNA的切割  46-47
      1.3.2.3 RISC的形成  47-48
      1.3.2.4 mRNA的降解  48
    1.3.3 RNAi的作用特点  48-49
    1.3.4 RNAi的生理意义  49-50
      1.3.4.1 调控细胞的分化与发育  49
      1.3.4.2 RNA水平上的反馈调节  49-50
      1.3.4.3 抗病毒作用  50
    1.3.5 RNAi的设计和应用  50-56
      1.3.5.1 RNAi的设计  50-52
        1.3.5.1.1 RNAi目标序列的选择  50-51
        1.3.5.1.2 siRNA的获得  51-52
          1.3.5.1.2.1 体外制备  51-52
          1.3.5.1.2.2 体内表达  52
      1.3.5.2 RNAi的应用  52-56
        1.3.5.2.1 RNAi在基因功能探索中的应用  52-53
        1.3.5.2.2 RNAi在基因治疗方面的应用  53-55
        1.3.5.2.3 RANi在抗病毒方面的的应用  55-56
    1.3.6 microRNA (miRNA)  56-58
    1.3.7 RNAi研究进展  58-60
  1.4 本研究的目的和意义  60-61
第二章猪α-干扰素基因的克隆及抗病毒活性的初步研究  61-81
  2.1 引言  61
  2.2 材料和方法  61-73
    2.2.1 材料  61-62
    2.2.2 方法  62-73
      2.2.2.1 病毒的扩增、保存及滴度的测定  62-63
      2.2.2.2 α-干扰素基因的克隆  63-69
      2.2.2.3 α-干扰素在PK细胞中的表达  69-72
      2.2.2.4 α-干扰素抗病毒活性的初步鉴定  72-73
  2.3 结果  73-79
    2.3.1 FMDV的扩增及滴度的测定  73-74
    2.3.2 α-干扰素基因的PCR扩增  74-75
    2.3.3 重组质粒的鉴定  75-76
    2.3.4 α-干扰素在PK细胞中表达  76-78
    2.3.5 α-干扰素基因在PK细胞中表达产生的抗病毒活性  78-79
  2.4 讨论  79-81
第三章在IRES调控下猪α-干扰素表达及其抗病毒作用的研究  81-102
  3.1 引言  81
  3.2 材料和方法  81-90
    3.2.1 材料  81-83
    3.2.2 方法  83-90
      3.2.2.1 α-干扰素基因序列连接到pcDNA3.1(+)  83
      3.2.2.2 IRES的克隆和突变体获得  83-86
      3.2.2.3 重组质粒在PK细胞中的表达及鉴定  86-87
      3.2.2.4 α-干扰素在IRES的作用下抗病毒效果的测定  87-88
      3.2.2.5 ELISA检测  88-90
  3.3 结果  90-100
    3.3.1 α-干扰素基因连接到载体pcDNA3.1(+)  90
    3.3.2 FMDV IRES基因的RT-PCR扩增  90-91
    3.3.3 FMDV IRES及突变产物连入pc-IFN  91-92
    3.3.4 重组质粒转染细胞及在细胞中的表达  92-94
    3.3.5 外源α-干扰素抗病毒活性的鉴定  94-100
  3.4 讨论  100-102
第四章 miRNA抑制FMDV基因组RNA的复制  102-111
  4.1 引言  102
  4.2 材料和方法  102-106
    4.2.1 材料  102-103
    4.2.2 方法  103-106
      4.2.2.1 miRNA表达质粒的构建  103-105
      4.2.2.2 稳定表达miRNA细胞系的筛选  105-106
  4.3 结果  106-109
    4.3.1 miRNA表达质粒p3D-1250的构建  106-107
    4.3.2 p3D-1250转染BHK-21细胞后稳定表达细胞系的初步筛选  107-108
    4.3.3 p3D-1250转染BHK-21细胞后抗病毒效果的鉴定  108-109
  4.4 讨论  109-111
研究总结  111-112
参考文献  112-132
在读期间发表的论文  132-133
致谢  133

IRES调控α-干扰素的抗FMDV研究

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