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mWAP-hLTF杂合基因座载体的构建及其在转基因小鼠乳腺中表达的研究

作　者: 施庚寿
导　师: 邓继先；陈红星
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: 细菌人工染色体 Gap-repar 乳清酸蛋白 乳铁蛋白
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


人乳铁蛋白(LTF)富含于人母乳初乳中,具有广谱抗菌、调节体内铁平衡、促进细胞生长等广泛生理作用。由于来源的问题,因而生产的成本很高,价格昂贵。利用动物乳腺生物反应器来生产不仅维持生产的成本低,而且产量高,能够进行翻译后修饰、正确折叠。但位置效应的影响是其主要技术瓶颈之一。细菌人工染色体(BAC)上完整的乳蛋白基因座,包含位点独立性表达所需的全部元件,作为转基因载体就有可能克服外源基因整合时位置效应的影响。本研究构建了小鼠乳清酸蛋白(mWAP)完整调控序列与人乳铁蛋白(hLTF )基因组序列连在一起的杂合基因座,利用mWAP基因完整调控序列指导hLTF基因组序列在转基因小鼠乳腺内高效表达。我们以pBR322载体为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构建成能连续进行三次gap-repair的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内,利用λ噬菌体Red同源重组系统介导的同源重组方法,分三步连续地从含mWAP基因座的BAC和含hLTF基因座的BAC上亚克隆了8Kb的mWAP基因3’端完整侧冀序列,29Kb的hLTF基因组序列和12Kb的mWAP基因5’端完整侧冀序列,并使它们自动无痕地连接成一个全长约49Kb的mWAP-hLTF杂合基因座。经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,我们构建的这个杂合基因座,达到了原来mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)被hLTF基因组序列精确置换的目的。然后,将构建好的mWAP-hLTF杂合基因座乳腺表达载体通过受精卵原核显微注射的方法制备转基因小鼠,获得了5个乳汁中高效稳定表达重组人LTF的转基因小鼠系,表达量最低为16.0mg/ml,最高为19.6mg/ml,平均为18.1mg/ml。由此建立了连续Gap-repair构建杂合基因座乳腺表达大载体的技术,并证明这种杂合基因座大载体在转基因小鼠乳腺中的表达能够克服位置效应的影响,达到位点独立性的稳定高效表达。这将为以后大动物乳腺生物反应器商业化生产人LTF奠定了坚实的基础,也为乳腺生物反应器高效表达大载体的的研究提供了一种全新思路和方法。

全文目录


中文摘要  5-6
英文摘要  6-8
缩略词表  8-9
第一章 绪论  9-17
  一.乳铁蛋白研究现状  9-10
  二.人工染色体在乳腺生物反应器中的应用  10-13
  三.Red 同源重组在构建杂合型基因座乳腺表达载体中的应用  13-15
  参考文献  15-17
第二章 三步连续‘Gap-repair’构建小鼠WAP－人LTF 杂合基因座  17-40
  前言  17-18
  1 实验材料  18-21
  2 实验方法  21-32
  3 结果  32-37
  4 讨论  37-39
  参考文献  39-40
第三章 mWAP－hLTF 杂合基因座在转基因小鼠乳腺中表达的研究  40-58
  前言  40
  1 实验材料  40-41
  2 实验方法  41-49
  3 结果  49-53
  4 讨论  53-56
  参考文献  56-58
总结  58-59
致谢  59-60
附文献综述  60-66

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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