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转基因牛乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白食用安全性和功能研究

作　者: 王小丹
导　师: 严卫星；徐海滨；刘珊
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 卫生毒理学
关键词: 人乳铁蛋白转基因等同性食用安全性生长发育抑菌缺铁性贫血
分类号: R151
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的研究转人乳铁蛋白基因牛乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白的食用安全性,以及其改善生长发育功能、体外抑菌作用和改善机体铁营养状况的功能。方法一等同性分析从结构、免疫反应性和生理活性三方面对rhLf和天然hLf进行等同性分析。结构分析包括分子量测定、N端氨基酸序列分析、糖基化位点确定和二级结构测定；免疫反应性通过Western-Blot进行检测,利用anti-hLf分别与rhLf和天然hLf进行免疫反应,比较二者是否具有相同的免疫反应性；生理活性方面针对rhLf的铁结合和释放能力进行测定。二食用安全性研究1.毒性研究进行生物信息学分析,比较rhLf与已知毒蛋白和抗营养素是否具有同源性；以5g/kg bw/d剂量进行大鼠7天经口毒性实验,以35g/kg bw/d剂量进行小鼠28天喂养实验,评价rhLf短期摄入对实验动物能否产生有害健康影响。2.致敏性研究进行生物信息学分析,比较rhLf与已知致敏蛋白是否具有同源性；进行rhLf与天然hLf在模拟胃/肠液和小型猪生理胃/肠液中的消化实验,分析rhLf是否具有消化抗性,并比较rhLf与天然hLf的消化稳定性是否一致。三功能研究1.改善生长发育功能设低、中、高三个rhLf剂量组(0.375、0.75和2.25g/kg bw/d)和一个水对照组,灌胃给予受试物,周期为8周。检测指标包括动物体重、身长、摄食量和食物利用率。2.体外抑菌功能利用体外培养方法,分别在大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的培养体系中加入不同浓度rhLf,测定上述细菌在不同时间点的生长情况。3.改善铁营养状况功能建立贫血模型：雌性断乳Wistar大鼠喂饲低铁饲料30d后,选择Hb低于100/L的动物进入恢复实验。贫血恢复实验：按Hb和体重将大鼠随机分为A-F6组,依次为模型对照组,0.375、0.75和2.25g/kg bw rhLf组,0.011g/kg bw乳酸亚铁组,以及0.011g/kg bw乳酸亚铁联合0.375g/kg bw rhLf组,每组12只,灌胃给予受试物,恢复周期为8周。检测指标包括动物一般情况、体重变化、铁相关血液学指标、FEP、SI、TIBC、TS、SF、SC和SZ。结果一等同性分析rhLf与天然hLf分子量相近,N端氨基酸序列相同,糖基化位点一致,二级结构相似,具有相同的免疫反应性,且均具有铁结合与释放能力。二食用安全性研究1.毒性研究1.1生物信息学分析在UniProt数据库中利用BLAST程序共查找出530种与rhLf具有序列同源性的蛋白,全部为转铁蛋白家族(transferrin family)成员。1.2大鼠7天经口毒性实验经口给予5g/kg bw/d rhLf连续7天,动物体重显著降低。以3.3g/kg bw/d蛋白粉重复进行大鼠7天经口毒性实验出现相同结果,提示大量灌胃给予蛋白质的经口毒性实验方法不能正确评价受试物的毒性。停止处理因素2周后,rhLf组和蛋白粉组体重、摄食量和食物利用率与对照组均无差异。rhLf组脏器重量、血液学、血生化以及组织病理学检查结果均未显示不良影响。1.3小鼠28天喂养实验以35g/kg bw/d剂量喂养小鼠28天,rhLf组雄性动物第4周体重显著高于酪蛋白组,PLT、RDW、TP和ALB增高,睾丸相对重量降低。雌性动物ALT、TRIG和肾脏相对重量增高,TP和CRE降低。其他指标在两组间均无差异,组织病理学检查未显示不良影响。2.致敏性研究rhLf与牛乳转铁蛋白、鸡卵转铁蛋白和豚草属花粉变应原Amb p 5三种已知致敏原具有序列或结构同源性。rhLf与hLf在模拟胃／肠液和生理胃／肠液中的消化稳定性一致,在胃液中易被消化,而在肠液中60min内不能被消化。三功能研究1.改善生长发育功能2.25g/kg bw/d rhLf组体重、身长和食物利用率均显著优于对照组,0.375和0.75g/kg bw/d rhLf组较对照组有轻度改善。2.体外抑菌功能rhLf在体外对大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的生长均具有抑制作用,且在一定范围内rhLf浓度越大,抑制作用越强。不同菌株对rhLf敏感性不同,在相同条件下,单增李斯特菌对rhLf最为敏感。3.改善铁营养状况功能乳酸亚铁组和乳酸亚铁联合低剂量rhLf组动物一般情况较模型对照组明显改善,体重、RBC、Hb、SI、TS和SF显著增加,FEP、TIBC和SZ显著降低；2.25g/kg rhLf组上述指标较模型对照组同样显著改善,但程度低于乳酸亚铁组和乳酸亚铁联合rhLf组；0.75g/kg rhLf组RBC显著增加,FEP和SZ降低；0.375g/kg rhLf组仅SZ显著低于对照组,其他指标无差异。乳酸亚铁组和乳酸亚铁联合rhLf组之间比较时,后者SI、TS和SF显著高于前者,TIBC低于前者。结论一rhLf与天然hLf在结构、免疫反应性和生理活性三方面均具有等同性。二生物信息学研究证实,rhLf与已知毒蛋白或抗营养素不具有同源性；与牛乳转铁蛋白、鸡卵转铁蛋白和豚草属花粉变应原Amb p 5三种已知致敏原具有同源性,但发生交叉致敏的可能性较小三首次采用蛋白替代法以高达35g/kg bw/d的剂量进行了rhLf28天喂养实验,结果显示对小鼠无毒性作用,证明rhLf具有良好的食用安全性。四rhLf与hLf在模拟胃/肠液和小型猪生理胃/肠液中的消化稳定性一致,均不具有消化抗性。五首次证实转基因牛乳腺生物反应器表达的rhLf具有改善大鼠生长发育、体外抑制多种细菌生长和改善缺铁性贫血大鼠铁营养状况的功能。

全文目录

中英文缩略词表  8-11
摘要  11-15
Abstract  15-19
前言  19-22
第一章重组人乳铁蛋白与天然人乳铁蛋白的等同性分析  22-33
  一、结构分析  22-26
    1. 分子量测定  22-23
    2. N端氨基酸序列测定  23-24
    3. 糖基化分析  24-26
    4. 二级结构比较  26
  二、免疫反应性分析  26-27
    1. 材料  26
    2. 方法  26
    3. 结果  26-27
    4. 讨论  27
  三、生理活性分析—铁结合与释放能力  27-32
    1. 材料  27
    2. 方法与结果  27-31
    3. 讨论  31-32
    4. 小结  32
  四、本章小结  32-33
第二章重组人乳铁蛋白的食用安全性研究  33-66
  一、重组人乳铁蛋白的毒性研究  33-50
    (一) 生物信息学分析  33-36
      1. 方法  34
      2. 结果  34-35
      3. 讨论  35-36
    (二) 大鼠7天经口毒性实验  36-39
      1. 方法  36-37
      2. 结果  37-38
      3. 讨论  38-39
    (三) 大鼠7天经口毒性补充实验  39-44
      1. 方法  39-40
      2. 结果  40-43
      3. 讨论  43-44
    (四) 小鼠28天喂养实验  44-50
      1. 方法  44-45
      2. 结果与讨论  45-50
      3. 小结  50
  二、重组人乳铁蛋白的致敏性研究  50-65
    (一) 生物信息学分析  50-56
      1. 方法与结果  51-54
      2. 结果分析  54-55
      3. 讨论  55-56
    (二) 消化稳定性分析  56-65
      1. 原理  56
      2. 材料与方法  56-60
      3. 结果  60-64
      4. 讨论  64-65
  三、本章小结  65-66
第三章重组人乳铁蛋白的功能研究  66-92
  一、改善大鼠生长发育功能研究  66-74
    1. 方法  66-68
    2. 结果  68-70
    3. 讨论  70-74
  二、体外抑菌功能研究  74-81
    1. 材料和方法  74-76
    2. 结果  76-80
    3. 讨论  80-81
  三、改善缺铁性贫血大鼠铁营养状况的功能研究  81-90
    1. 方法  81-84
    2. 结果  84-87
    3. 讨论  87-90
    4. 小结  90
  四、本章小结  90-92
研究结论  92-93
参考文献  93-98
致谢  98-99
附录一发表文章  99-108
附录二个人简历  108

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