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南极大磷虾（Euphausia superba）胰蛋白酶样酶分离纯化、酶学性质探索及其生物学活性研究

作　者: 向宇
导　师: 姜国良
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 南极大磷虾胰蛋白酶样酶分离纯化酶学性质生物学活性
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

南极大磷虾隶属于节肢动物门甲壳纲,是南极生态系统的关键物种,资源丰富,具有巨大的开发和利用潜力。国外研究表明,南极大磷虾体内含有多种蛋白酶,能清除机体坏死组织和细胞、治疗角膜碱烧伤和消除牙斑等,具有广泛的医学用途,而其体内蛋白酶活性40%来源于胰蛋白酶。因此,对其胰蛋白酶样酶进行分离纯化,酶学性质探索和生物学活性研究,具有一定的理论和应用价值。本文采用20-70%饱和度硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S100凝胶过滤柱层析和DEAE Sepharose-F.F离子交换柱层析,纯化得到一种胰蛋白酶TLEⅠ,分子量大约在30.0KDa,纯化倍数为3.19。胰蛋白酶酶学性质研究发现:酶促反应的速率受pH、温度影响。在37°C,以BApNA为底物的反应体系中,在较广泛的pH范围（3.0¹1.0）内,酶具有活性,最适宜反应pH在7.0⁹.0之间;在pH 8.0,以BApNA为底物的反应体系中,酶在较广泛的温度范围（4-80°C）内具有活性,反应最适宜温度为30°C⁵0°C。Mg²⁺、Ca²⁺（0⁰.5 mmol/L）对胰蛋白酶有一定的激活作用。Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、丙三醇和丙酮对胰蛋白酶有一定的抑制作用。Mn²⁺、乙醇和二甲基亚砜在低浓度时对酶起激活作用,高浓度下表现为抑制作用。建立兔机械创伤模型,以提取的粗酶、纯化酶、木瓜蛋白酶和生理盐水分别涂抹伤口,以肉眼观察和伤口愈合面积为指标对比各组实验结果。结果显示,粗酶和纯化酶都有很好的效果,粗酶更佳。分别采用番泻叶、大黄、5-羟色胺（5-HT）建立小鼠腹泻模型1h后,以生理盐水为阴性对照,思密达为阳性对照,分别灌胃不同剂量(20mg.kg^-1和40mg.kg^-1)的南极磷虾蛋白酶制剂,统计6h内小鼠腹泻发生率和腹泻累积次数。结果显示,南极磷虾蛋白酶可显著降低番泻叶引起的小鼠腹泻次数,降低大黄,5-羟色胺引起的小鼠腹泻次数。采用右旋葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠溃疡性结肠炎（UC）模型,以生理盐水为阴性对照,柳氮磺胺吡啶为阳性对照,分别灌胃不同剂量(20mg.kg^-1和40mg.kg^-1)的南极磷虾蛋白酶制剂,通过肉眼及实体观察,EGF的测定,组织切片观察对比各组实验结果。结果显示:灌胃南极磷虾蛋白酶的小鼠在饮用DSS诱导UC后,能够保持良好的精神状态,少有便血现象,并能抑制小鼠体重的减轻;同时,南极磷虾蛋白酶能够明显提高UC小鼠血液中EGF表达水平,从组织切片结果来看,南极磷虾蛋白酶也能降低溃疡症状的发生,其作用效果在一定程度上与其浓度成正比。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章南极大磷虾及其蛋白酶研究进展  13-24
  1 南极大磷虾研究现状  13-15
  2 南极大磷虾磷虾酶应用  15-16
  3 胰蛋白酶的酶学性质  16-17
  4 溃疡性结肠炎及腹泻研究进展  17-20
  5 胰蛋白酶的应用价值  20-22
    5.1 胰蛋白酶在医药方面的应用  20-22
    5.2 胰蛋白酶在轻工业方面的应用  22
  6 研究目的及意义  22-24
第二章南极大磷虾胰蛋白酶样酶分离纯化及酶学性质探索  24-44
  1 实验用品  24-26
    1.1 实验材料  24
    1.2 实验仪器设备  24-25
    1.3 实验药品  25-26
  2 实验方法  26-34
    2.1 可溶性蛋白质浓度测定  26-27
    2.2 酶活性测定方法  27-28
    2.3 胰蛋白酶纯化路线  28
    2.4 粗酶液样品制备  28-29
    2.5 硫酸铵分级沉淀  29
    2.6 Sephacryl S100 凝胶过滤柱层析  29-30
      2.6.1 Sephacryl S100 凝胶的准备  29
      2.6.2 凝胶过滤层析柱的预装  29
      2.6.3 凝胶过滤柱层析  29-30
    2.7 DEAE Sepharose-Fast Flow 离子交换柱层析  30-31
      2.7.1 DEAE Sepharose-Fast Flow 凝胶的准备  30
      2.7.2 离子交换层析柱的预装  30
      2.7.3 离子交换柱层析  30-31
    2.8 SDS-PAGE  31-33
      2.8.1 溶液配制  31-32
      2.8.2 电泳  32-33
    2.9 pH 对酶促反应速率的影响  33
    2.10 温度对酶促反应速率的影响  33
    2.11 不同金属离子对酶促反应速率的影响  33
    2.12 不同有机溶剂对酶促反应速率的影响  33-34
  3 结果与分析  34-43
    3.1 硫酸铵分级沉淀  34
    3.2 凝胶过滤柱层析  34-35
    3.3 离子交换柱层析  35
    3.4 胰蛋白酶纯化  35-36
    3.5 SDS-PAGE  36
    3.6 pH 对酶促反应速率的影响  36-37
    3.7 温度对酶促反应速率的影响  37-38
    3.8 不同金属离子对酶促反应速率的影响  38-41
    3.9 不同有机溶剂对酶促反应速率的影响  41-43
  4 小结  43-44
第三章南极大磷虾胰蛋白酶生物学活性研究  44-65
  1 实验用品  44-45
    1.1 实验材料  44
    1.2 实验仪器设备  44-45
    1.3 实验药品  45
  2 实验方法  45-54
    2.1 南极大磷虾胰蛋白酶清创功能初步研究  45-46
      2.1.1 创伤模型的建立  45
      2.1.2 给药  45-46
      2.1.3 创面愈合情况  46
      2.1.4 残余创面面积及创面愈合时间  46
    2.2 南极大磷虾蛋白酶制剂对小鼠腹泻的影响  46-47
      2.2.1 南极大磷虾蛋白酶的制备  46
      2.2.2 对番泻叶引起小鼠腹泻的影响  46
      2.2.3 对大黄引起小鼠腹泻的影响  46-47
      2.2.4 对5-羟色胺引起小鼠腹泻的影响  47
    2.3 南极大磷虾蛋白酶制剂对小鼠实验性溃疡性结肠炎（UC）作用的初步观察  47-54
      2.3.1 南极大磷虾蛋白酶的制备  47
      2.3.2 小鼠实验性溃疡性结肠炎模型的建立  47-48
      2.3.3 一般情况观察  48
      2.3.4 实体显微镜检查  48
      2.3.5 血清中表皮生长因子（EGF）含量的测定  48-49
      2.3.6 结肠组织切片观察  49-54
  3 结果与分析  54-62
    3.1 南极大磷虾胰蛋白酶清创功能初步研究  54-56
      3.1.1 总体形态学观察结果  54-55
      3.1.2 创面愈合面积测定结果  55-56
    3.2 南极大磷虾蛋白酶制剂对小鼠腹泻影响研究  56-58
      3.2.1 南极大磷虾蛋白酶制剂对番泻叶引起小鼠腹泻  56
      3.2.2 南极大磷虾蛋白酶制剂对大黄引起小鼠腹泻的影响  56-57
      3.2.3 南极大磷虾蛋白酶制剂对5-羟色胺引起小鼠腹泻的影响  57-58
    3.3 南极大磷虾蛋白酶制剂对小鼠实验性溃疡性结肠炎（UC）作用的初步观察  58-62
      3.3.1 溃疡性结肠炎小鼠一般情况观察  58
      3.3.2 实体显微镜检查  58-59
      3.3.3 小鼠血清中EGF 含量的测定  59
      3.3.4 组织切片观察（肠管横切）  59-62
  4 小结  62-65
结论  65-66
参考文献  66-75
致谢  75

南极大磷虾（Euphausia superba）胰蛋白酶样酶分离纯化、酶学性质探索及其生物学活性研究

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