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新型抗生素候选替代物

作　者: 肖颖
导　师: 黄天培；关雄
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苏云金芽胞杆菌细菌素抗菌活性作用机制
分类号: TQ465
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

细菌素(Bacteriocin)是细菌在代谢过程中由核糖体合成基因编码的一类具有生物活性的多肽或蛋白质类物质。因其高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性及良好的生物相容性等优点,在食品行业中具有广阔的应用前景。本研究采用双层平板法进行产细菌素苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis,简称Bt)菌株的初筛。结果表明:在93株Bt菌株(7株标准株和86株野生株)中共有75株(3株标准株和72株野生株)对53株(16种)食源性病原细菌产生不同大小的抗菌活性。通过细菌素产生菌的复筛,发现供试标准株Bt HD1、4AJ1和4BD1具有较广的抗菌谱,能够对许多革兰氏阳性菌产生抗菌活性,如蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus,简称Bc)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes ,简称Lm )、肠球菌( Enterococcus )、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称Sa)。此外,它们还能对部分革兰氏阴性菌产生抗菌活性,如沙门氏菌(Salmonella)。对其菌株发酵上清液产细菌素的动态监测结果表明,0~8 h时菌株Bt HD1、4AJ1和4BD1处于指数生长期,均对Bc 0938、Bc ATCC 109873和Lm ATCC 15313没有抗菌活性;Bt HD1和4AJ1发酵上清液的抗菌活性在10 h能够检测到,而Bt 4BD1发酵上清液在24 h才出现抗菌活性。随着培养时间的延长,发酵上清液的抗菌效果逐渐提高;24~36 h时,菌株Bt HD1、4AJ1和4BD1处于稳定期且抗菌活性处于较高水平;当菌株培养至后期,抗菌活性下降直至丧失。在动态监测的过程中,出现菌株发酵上清液抗菌活性波动甚至中断的现象。通过饱和硫酸铵沉降获得饱和硫酸铵沉降的细菌素。结果表明,当饱和硫酸铵质量分数为50%~100%时,Bt HD1、4AJ1和4BD1的部分纯化细菌素的抗菌活性处于较高水平,tricine-SDS-PAGE电泳结果表明沉降后蛋白的条带相对较丰富、蛋白量也相对较多。经质量分数为70%的饱和硫酸铵沉降,获得在SDS-PAGE凝胶原位活性检测上显示为分子量为约6.5 kDa的抗菌物质。蛋白酶K不影响饱和硫酸铵沉降的细菌素活性;经胰凝乳蛋白酶处理后,饱和硫酸铵沉降的细菌素抗菌活性大大降低;经脂肪酶处理后活性则部分丧失。饱和硫酸铵沉降的细菌素能在80℃的环境中存在,具有较好的热稳定性,具有较广的pH耐受范围(pH 3~9)。Bt HD1和4AJ1细菌素对食源性病原细菌敏感菌的作用方式主要是杀菌和溶菌,对芽胞萌发有很好的抑制作用;Bt 4BD1对敏感菌的作用方式则主要是抑菌,对芽胞萌发没有抑制作用。Bt HD1、4AJ1和4BD1对多数抗生素都比较敏感,仅对阿莫西林、头孢唑啉、亚胺培南和苯唑西林具有耐药性,对其它11种抗生素敏感。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章前言  12-26
  1 研究背景  12-13
  2 细菌素  13-20
    2.1 细菌素的定义  13
    2.2 细菌素的分类  13-15
    2.3 细菌素与抗生素、其他抗菌肽的区别  15-16
      2.3.1 细菌素与抗生素的区别  15
      2.3.2 细菌素与其他抗菌肽的区别  15-16
    2.4 细菌素的抑菌谱  16-17
    2.5 细菌素的理化特性  17
    2.6 细菌素的作用机制  17-18
    2.7 细菌素的应用  18-20
      2.7.1 细菌素在食品防腐中的应用  18-19
      2.7.2 细菌素在医学中的应用  19
      2.7.3 细菌素在饲料中的应用  19-20
  3 苏云金芽胞杆菌细菌素  20-24
    3.1 苏云金芽胞杆菌  20-21
    3.2 苏云金芽胞杆菌细菌素的研究概况  21-24
      3.2.1 苏云金芽胞杆菌细菌素的分类  21-22
      3.2.2 苏云金芽胞杆菌细菌素的研究现状  22-24
  4 本研究的立题依据和意义  24-26
第二章材料与方法  26-40
  1 材料  26-33
    1.1 供试菌株  26
    1.2 培养基  26-29
    1.3 试剂  29-33
      1.3.1 Tricine-SDS-PAGE 试剂  29
      1.3.2 SDS-PAGE 试剂  29-32
      1.3.3 其他试剂  32-33
    1.4 酶类  33
  2 方法  33-40
    2.1 细菌培养  33
    2.2 细菌素产生菌的筛选  33-34
    2.3 菌株发酵液产生细菌素的动态监测  34-35
    2.4 最佳硫酸铵浓度的选择  35-36
      2.4.1 细菌素的部分纯化  35
      2.4.2 Tricine-SDS-PAGE  35-36
    2.5 SDS-PAGE 与凝胶原位抗菌活性检测  36-38
    2.6 细菌素的理化特性  38
      2.6.1 细菌素对酶的稳定性  38
      2.6.2 细菌素对温度的敏感性  38
      2.6.3 细菌素对pH 的敏感性  38
    2.7 细菌素的抗菌作用方式  38-39
    2.8 Bt 菌株对食品中常见的污染抗生素敏感性测定  39-40
第三章结果与分析  40-67
  3.1 细菌素产生菌的筛选  40-46
  3.2 菌株发酵液产生细菌素的动态监测  46-50
  3.3 最佳硫酸铵浓度的选择  50-55
    3.3.1 细菌素的部分纯化  50
    3.3.2 SDS-PAGE  50-55
  3.4 细菌素理化特性的测定  55-61
    3.4.1 细菌素对酶的稳定性  55-56
    3.4.2 细菌素对温度的敏感度  56
    3.4.3 细菌素对pH 的敏感度  56-61
  3.5 细菌素的作用方式  61-65
    3.5.1 细菌素对营养细胞的作用方式  61-62
    3.5.2 细菌素对芽胞的作用方式  62-65
  3.6 Bt 菌株对食品中常见的污染抗生素敏感性测定  65-67
第四章讨论  67-69
第五章结论与展望  69-72
  5.1 结论  69-70
  5.2 展望  70-72
参考文献  72-77
硕士期间发表、投稿论文  77-78
致谢  78

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