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小鼠、大鼠、猪DHRS4基因原核表达载体的构建、表达及小鼠DHRS4多克隆抗体的制备

作　者: 张廷银
导　师: 黄东阳
学　校: 汕头大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: DHRS4 基因克隆 蛋白表达 多克隆抗体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶（ NADP（H）-dependent retinol dehydrogenase/reductase,NRDR）是全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,atRA）代谢生成途径中的一种关键酶。atRA在体内是由维生素A（Vitamin A）即视黄醇（Retinol）经过两步代谢生成,中间的代谢产物为视黄醛（Retinal）,辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶在从Retinol到Retinal这一步中起着关键作用。NRDR基因位于人的14q11.2,包含三个拷贝,分别命名为DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1,但在其他哺乳动物体内多只存在DHRS4一个单拷贝,如大鼠、小鼠、猪、牛、马、狗等。在另外一些动物中只存在有两个拷贝,其分别为DHRS4和DHRS4L1,如黑猩猩、类人猿。对于人体内NRDR的研究发现其存在比较复杂的调控表达方式,通过小鼠这样的只有DHRS4一个单拷贝的动物作为一个模型进行研究能帮助我们进一步探寻人体内NRDR调控表达,因此,DHRS4原核表达载体的构建及小鼠多克隆抗体为本课题组以小鼠作为模型进行研究提供了帮助。对于辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶在生物体内所发挥的作用及其酶活性,本课题组已对兔子体内该酶所发挥的作用做了深入的研究,发现这种酶不仅具有很高的催化视黄醇、视黄醛之间氧化还原的活性,而且对其他类似视黄醇、视黄醛的醛酮类物质存在氧化还原活性。对于其他动物体内该酶的活性,近年来有文章发现各种动物体内该酶的作用存在差异,特别是在人体内该酶的作用,目前尚少有报道。因此,有必要深入研究其所起的生理功能及其差异。但是,该酶在体内含量低,分离纯化困难。通过体外表达可以得到大量重组酶,从而为DHRS4基因表达调控及功能研究提供实验原料。方法:应用RT-PCR从大鼠、小鼠、猪肝组织扩增DHRS4的开放阅读框序列,测序确认后将其编码区构建到载体pDONRTM201上,再通过LR反应再将其置换到表达载体pDESTTM 17上,测序确认后转化到E.coli BL21-AI工程菌中,并经阿拉伯糖诱导表达出DHRS4融合蛋白。以小鼠融合蛋白作为免疫原免疫大白兔,制备小鼠DHRS4多克隆抗体。结果:成功构建大鼠、小鼠、猪DHRS4重组质粒;转化重组质粒的E.coli BL21-AI经阿拉伯糖诱导4 h后高效表达DHRS4融合蛋白;Western bolt实验结果显示制备的多克隆抗体可特异性检测小鼠肝组织DHRS4蛋白的表达。结论:成功构建大鼠、小鼠、猪pDESTTM 17 /DHRS4原核表达载体和获得小鼠抗DHRS4多克隆抗体。

全文目录


中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
缩略词简表  8-13
第一章 前言  13-18
  1.1 背景  13-17
    1.1.1 辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶NRDR 与维甲酸atRA  13-14
    1.1.2 原核表达载体、原核表达和入门克隆技术Gateway Technology  14-16
    1.1.3 多克隆抗体  16-17
  1.2 本项研究课题的研究意义  17
  1.3 研究目标与研究内容  17-18
    1.3.1 研究目标  17
    1.3.2 研究内容  17-18
第二章 大鼠、小鼠、猪DHRS4编码区cDNA克隆  18-29
  2.1 实验材料  18-20
    2.1.1 动物来源  18
    2.1.2 细菌和载体  18
    2.1.3 主要试剂盒及试剂配制  18-20
    2.1.4 主要仪器  20
  2.2 实验方法  20-26
    2.2.1 组织  20-21
    2.2.2 提取肝组织总RNA  21
    2.2.3 RNA 逆转录成cDNA  21-22
    2.2.4 PCR 扩增DHRS4 cDNA  22-23
    2.2.5 胶回收目的片段  23
    2.2.6 将目的片段连接至pGEM-T 质粒  23-24
    2.2.7 转化  24
    2.2.8 重组质粒的初步筛选  24-25
    2.2.9 测序确认  25-26
  2.3 实验结果  26-29
    2.3.1 总RNA 浓度  26
    2.3.2 全长cDNA 的克隆  26
    2.3.3 大鼠、小鼠、猪DHRS4 克隆片段的鉴定  26-29
第三章 大鼠、小鼠、猪DHRS4表达载体的构建、表达和纯化  29-44
  3.1 实验材料  29-32
    3.1.1 菌种及质粒  29
    3.1.2 主要试剂盒及试剂配制  29-31
    3.1.3 主要仪器  31-32
  3.2 实验方法  32-38
    3.2.1 感受态细胞的制备  32-33
    3.2.2 提取重组质粒  33-34
    3.2.3 扩增带attB 重组位点的DHRS4 PCR 片段  34-35
    3.2.4 入门克隆的构建  35-36
    3.2.5 入门克隆的鉴定  36
    3.2.6 表达克隆的构建  36-37
    3.2.7 表达克隆的表达及纯化  37-38
  3.3 实验结果  38-44
    3.3.1 带attB 重组位点的修饰  38-39
    3.3.2 菌落PCR 确认入门克隆  39-40
    3.3.3 测序确认入门克隆  40
    3.3.4 菌落PCR 确认表达克隆  40
    3.3.5 大鼠、小鼠、猪DHRS4 在BL21-AI~(TM)细胞中的表达  40-42
    3.3.6 蛋白纯化  42-44
第四章 小鼠DHRS4多克隆抗体的制备  44-49
  4.1 实验材料  44-45
    4.1.1 主要试剂盒及试剂配制  44
    4.1.2 主要仪器  44-45
  4.2 实验方法  45-48
    4.2.1 抗原制备  45
    4.2.2 抗血清的制备  45-46
    4.2.3 血清处理、储存  46
    4.2.4 抗体纯化  46-47
    4.2.5 抗体效价及特异性检测  47-48
  4.3 实验结果  48-49
    4.3.1 小鼠DHRS4 抗体效价检测  48
    4.3.2 小鼠DHRS4 抗体特异性检测  48-49
第五章 讨论  49-51
参考文献  51-56
硕士期间发表论文情况  56-57
个人简介  57-58
致谢  58

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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