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BPDE-DNA加合物体内外实验研究

作　者: 杨柳桦
导　师: 孙成均
学　校: 四川大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生
关键词: 紫外吸收光谱法高效液相色谱法液相色谱-质谱法苯并(a)芘 (7R,8S)-二羟基-(9S,10R)-环氧-7,8,9,10-四氢苯并(a)芘(BPDE) DNA加合物四醇-苯并(a)芘(BP-tetrol) 琼脂糖凝胶电泳
分类号: R117
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

苯并（a）芘是一种公认的人类致癌物，广泛存在于人类生活环境中，具有极强的致畸致癌致突变性，国内外均将其列为环境污染的监测项目之一。苯并（a）芘进入体内经代谢活化生成的（7R，8S）-二羟基-（9S，10R）-环氧-7．8，9，10-四氢苯并（a）芘（BPDE）可与DNA共价结合形成加合物。DNA加合物是一项重要的生物监测指标，是DNA分子化学损伤的最重要和最普遍的形式，这种加合物一旦逃避了生物细胞的自身修复系统，就可能成为致突变、致癌的最小因子。因此本实验对BPDE-DNA加合物进行了研究，探讨体内外BPDE-DNA加合物的生成条件，并建立了该加合物的高效液相色谱检测方法。体外实验：以一定比例将苯并（a）芘丙酮溶液、DNA溶液、S9混合液混合，于37℃孵育21h，用紫外分光光度计在190nm～400nm范围对孵育混合液和经同样孵育处理的DNA标准溶液进行扫描，根据DNA图谱特征吸收峰的改变，得出DNA结构改变的信息：同时用HPLC检测反应体系中残留的苯并（a）芘、苯并（a）芘的代谢产物（目标物BPDE）及DNA加合物酸水解后的产物（目标物BP-tetrol），并用质谱验证。动物实验：选用清洁级SD大鼠，一次性腹腔注射苯并（a）芘二甲基亚砜溶液（以1％羧甲基纤维素钠为助溶剂）150mg／kg，5h后取股静脉血，以4％的EDTA抗凝。用试剂盒提取全血中的DNA，采用琼脂糖凝胶电泳确认DNA的提取效果。将提取的DNA在0．1nmol／L HCl，90℃恒温水浴箱中酸水解4h，乙酸乙酯提取酸水解产物——四醇-苯并（a）芘（BP-tetrol），高效液相色谱法检测，最后质谱法验证DNA酸水解产物的结构。分析条件：色谱柱为Phenomenex（USA），C₁₈（ODS）柱，5μm，250×4．6mm；柱温为室温；流动相A为甲醇，B为乙酸-乙酸铵缓冲液（pH4．5±0．2）；梯度洗脱；流速1．0ml／min；荧光检测器检测(BPDE：λ_ex=338nm，λ_em=425nm；BP-tetrol：λ_ex=344nm，λ_em=398nm)。根据HPLC的检测结果，初步确定BPDE-DNA加合物的生成，最后用质谱验证苯并（a）芘代谢产物及DNA加合物酸水解产物的结构，LC-MS的分离条件同HPLC法。体外实验中的反应管经紫外扫描发现，反应后DNA紫外最大吸收峰红移，DNA标准最大吸收峰在259．1nm，孵育后最大吸收峰变为305．3nm，提示DNA构象发生改变；HPLC检测发现体外实验孵育管反应体系中苯并（a）芘含量降低，反应管与对照管比较有新的物质生成，DNA加合物酸水解管也有新物质生成，质谱分析生成物的分子量同于目标产物（BPDE分子量302．0，BP-tetrol分子量320．0）。动物实验中，BaP染毒组与溶剂对照组、阴性对照组比较，HPLC检测有新的色谱峰产生，质谱确定其分子量同于BP-tetrol。由以上紫外扫描结果及HPLC、LC-MS检测结果可得，在本实验条件下，BaP和DNA可在体外试管中和大鼠体内生成BPDE-DNA加合物；应用建立的HPLC方法能检测出体外生成的和大鼠血液中的BPDE-DNA加合物。本实验建立的HPLC检测DNA加合物的方法具有简单快速、操作简便、成本低廉等特点。

全文目录

本文出现的英文缩写  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
论文第一部分 BPDE-DNA加合物体外生成实验研究  12-35
  1 前言  12-14
  2 实验方法  14-19
    2.1 原理  14-15
    2.2 主要仪器  15-16
    2.3 试剂  16-17
    2.4 操作步骤  17-19
  3 结果与讨论  19-33
    3.1 反应条件的选择  19-23
    3.2 紫外扫描结果  23
    3.3 HPLC测定前处理及测定条件选择  23-27
    3.4 HPLC检测结果  27-30
    3.5 HPLC-MS检测结果  30-33
  4 结论  33
  参考文献  33-35
论文第二部分 DPDE-DNA加合物的动物实验研究  35-43
  1 前言  35-36
  2 实验方法  36-40
    2.1 原理  36
    2.2 实验动物  36-37
    2.3 主要仪器  37
    2.4 试剂  37-38
    2.5 操作步骤  38-40
  3 结果与讨论  40-42
    3.1 凝胶电泳结果  40
    3.2 HPLC检测结果  40-42
    3.3 LC-MS检测结果  42
  4 结论  42-43
参考文献  43-46
致谢  46-47
综述  47-82
  1 前言  47-52
  2 DNA的提取  52-59
  3 DNA加合物的检测方法  59-70
  4 展望  70-71
  参考文献  71-82
本人硕士在读期间情况简介  82-83

BPDE-DNA加合物体内外实验研究

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