学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

hTER定点突变对细胞生长的影响

作　者: 翁钰璟
导　师: 刘小川
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 端粒酶RNA 端粒 端粒结合蛋白 肿瘤治疗 转染
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 17次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


端粒存在于真核生物染色体末端,由特定的DNA重复序列及与之特异性结合的蛋白质构成。端粒长度随着细胞分裂次数的增加而逐渐缩短,能利用自身RNA模板合成端粒片段的端粒酶可以弥补复制时造成的片段缺失。在端粒功能调控中,还需一类结合蛋白的参与。端粒结合蛋白是特异结合在端粒不同位点并参与端粒各种功能的一类蛋白质的总称。端粒与端粒结合蛋白相互作用,保护染色体不被核酸酶降解,防止染色体末端融合,并克服由于DNA末端的复制缺陷造成的染色体末端缩短,保证了染色体的完整性。由于端粒酶合成端粒DNA并稳定染色体结构,在端粒功能中起着重要作用。因而定点突变端粒酶近模板序列的位点,可能对端粒酶的功能产生较大影响,对于肿瘤治疗来说具有重要意义和参考价值。本文通过克隆人端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTER)基因,采用重叠延伸PCR法(overlap extension PCR, OE-PCR)对端粒酶RNA近模板序列碱基A61A62/GG以及G63G64/AA进行定点突变,得到T1和T2两个突变的目的片段。将T1和T2两个目的片段分别与pMD18T载体连接,构建成pMD18-hTER重组质粒。两种连接产物分别转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA后,对重组质粒进行PCR和酶切鉴定。酶切产物纯化后,将其与真核表达载体pcDNA3.1(-)进行连接,再次转化E.coli DH5α感受态细胞。提取重组质粒,得到pcDNA-hTER片段,经酶切鉴定后,证实载体构建成功。构建真核表达载体的过程中,同时构建一个未突变的端粒酶RNA基因与pcDNA3.1(-)连接而成的重组质粒作为阳性对照,以及pcDNA3.1(-)空载体作为阴性对照。将T1、T2、阳性对照和阴性对照四个重组质粒转染进HeLa细胞中,经G418筛选后,每种重组质粒均形成了单克隆。对单克隆进行扩大培养,提取其总RNA,逆转录酶PCR法(reverse transcriptase-PCR, RT-PCR)检测到目的基因已整合到HeLa细胞基因组中,说明重组质粒在细胞中稳定表达。用MTT法对转染了不同重组质粒的HeLa细胞绘制生长曲线。结果表明,T1在一定程度上促进了细胞的生长,而T2在一定程度上抑制了细胞的生长。分析产生该种结果的原因,可能是由于T1突变体使端粒酶与端粒之间的结合变得更稳定,对端粒的合成起到促进作用,而T2突变体减弱了端粒酶与端粒之间的特异性结合,因此对细胞的分裂和生长起到了抑制作用。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-14
缩略语  14-15
第一章 文献综述  15-30
  1.1 端粒、端粒酶及端粒结合蛋白概述  15
  1.2 端粒研究背景及进展  15-18
    1.2.1 端粒的发现  15-16
    1.2.2 端粒的结构  16-17
    1.2.3 端粒长度动变机制  17-18
    1.2.4 端粒的功能  18
  1.3 端粒酶研究背景及进展  18-25
    1.3.1 端粒酶的结构及端粒酶RNA  19-21
    1.3.2 端粒酶的功能与调控  21-22
    1.3.3 端粒酶与肿瘤治疗  22-23
    1.3.4 端粒酶与细胞衰老  23-25
    1.3.5 端粒酶与其它人类疾病  25
  1.4 端粒结合蛋白研究背景及进展  25-29
    1.4.1 端粒结合蛋白的发现及分类  25-26
    1.4.2 Shelterin 复合体组成成分  26-28
    1.4.3 端粒结合蛋白的功能与调控  28-29
  1.5 染色体末端结构与基因治疗的前景  29-30
第二章 端粒酶RNA 基因突变体及真核表达载体pcDNA - hTER 的构建  30-48
  2.1 实验材料和试剂  31
    2.1.1 实验材料  31
    2.1.2 实验试剂  31
  2.2 实验方法  31-47
    2.2.1 人端粒酶RNA 基因的克隆  31-33
    2.2.2 重叠延伸PCR 法突变端粒酶RNA 基因  33-38
    2.2.3 质粒pMD18-hTER 的构建  38-43
    2.2.4 真核表达载体pcDNA-hTER 的构建  43-45
    2.2.5 结果与分析  45-47
  2.3 小结与讨论  47-48
第三章 稳定HeLa 细胞株的构建  48-56
  3.1 实验材料和试剂  48
    3.1.1 实验材料  48
    3.1.2 实验试剂  48
  3.2 实验方法  48-52
    3.2.1 HeLa 细胞铺板  48-49
    3.2.2 Effectene 试剂转染HeLa 细胞  49
    3.2.3 G418 筛选HeLa 细胞  49-50
    3.2.4 Trizol 法提取HeLa 细胞总RNA  50-51
    3.2.5 RT-PCR 检测目的基因的表达  51-52
  3.3 结果与分析  52-54
    3.3.1 转染及筛选结果  52-54
    3.3.2 RT-PCR 鉴定  54
  3.4 小结与讨论  54-56
第四章 分析端粒酶RNA 的定点突变对HeLa 细胞分裂、生长的影响  56-59
  4.1 实验材料和试剂  56
    4.1.1 实验材料  56
    4.1.2 实验试剂  56
  4.2 MTT 法绘制细胞生长曲线  56-57
  4.3 结果与分析  57
  4.4 小结与讨论  57-59
总结与展望  59-61
参考文献  61-65
致谢  65-67
附录：学位论文发表情况  67

相似论文

  1. 化疗对卵巢上皮性癌端粒长度的影响,R737.31
  2. YB-1 RNAi对肺腺癌细胞A549中MACC1基因表达影响的研究,R734.2
  3. 靶向人端粒G-四链体的有机小分子的设计合成和键合作用研究,TQ460.1
  4. 塞来昔布、丁酸钠对结肠癌HCT-116细胞增殖影响的实验研究,R735.35
  5. 胃癌中hPOT1和p53的表达及其与HP感染的相关性研究,R735.2
  6. 异常黑胆质成熟剂总酚与化疗药联合对Hela细胞的影响,R737.33
  7. HGF基因促进内皮祖细胞增殖的体外研究,R329
  8. 新型树枝状聚合物靶向药物载体的合成与表征,TQ460.1
  9. STAT3和hTERT在视网膜母细胞瘤中的表达及临床病理意义,R739.7
  10. 慢病毒载体介导的针对端粒酶的RNA干扰技术治疗肝癌的体内外研究,R735.7
  11. 亚硒酸钠对胃癌细胞株SGC-7901增殖、凋亡及hTERT表达的作用及其机理研究,R735.2
  12. 高危HPV亚型感染患者端粒酶检测对CIN诊断和随访的临床意义,R737.33
  13. 端粒缩短及DNA损伤与大肠癌的相关性研究,R735.34
  14. VEGF、telomerase与恶性腹水的相关性研究,R730.4
  15. 正常人及初发慢性粒细胞白血病白细胞中特定染色体相对端粒长度的研究,R733.7
  16. 表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG对人肝癌细胞株HepG2体外放疗的影响,R735.7
  17. RNAi靶向肝癌细胞hTERT后H2AX和DNMT3b基因表达的变化,R735.7
  18. 通过对分裂能力和端粒长度的分析研究小鼠胰岛祖细胞的存在,R587.1
  19. 斑蝥素对人白血病HL-60细胞株hTERT mRNA表达的影响及启动子甲基化作用初探,R285.5
  20. 端粒酶与p27蛋白在子宫内膜癌中的表达及其相关性研究,R737.33
  21. 斑蝥素干预急性髓细胞性白血病端粒酶逆转录酶（hTERT）甲基化的研究,R733.7

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com