苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)已被使用了近50年时间,其在细胞内形成的杀虫晶体蛋白(Insecidal crystal proteins, ICPs)对多种农业害虫和生活害虫具有防治效果。苏云金芽胞杆菌YBT-1520是本室从" />
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苏云金芽胞杆菌YBT-1520热胁迫下的生理变化及差异蛋白质组研究

作　者: 吴丹丹
导　师: 喻子牛；李明顺
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 苏云金芽胞杆菌 比较蛋白质组学 热胁迫 芽胞 杀虫晶体蛋白 聚β-羟基丁酸
分类号: S476.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


作为目前世界上成功商品化的生物杀虫剂,芽胞杆菌 的学位论文">苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)已被使用了近50年时间,其在细胞内形成的杀虫晶体蛋白(Insecidal crystal proteins, ICPs)对多种农业害虫和生活害虫具有防治效果。苏云金芽胞杆菌YBT-1520是本室从土壤中分离到的一株对棉龄虫、小菜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力的菌株(专利号ZL 95 106749.4)。本研究在生理学基础上结合高通量蛋白质组学技术对菌株YBT-1520在42℃热胁迫下胞内蛋白的变化进行了系统性地描述,对其主要生理特性的变化机理进行了探讨,对其热胁迫下的生存机制进行了揭示。热胁迫下Bt胞内蛋白主要发生了如下变化：(1)Ⅰ型和Ⅲ型热应激蛋白DnaK、GroEL、GrpE、ClpC在长时间热胁迫后仍处于诱导表达状态；(2)长时间热胁迫亦造成了BDH1、GuaB、GST非典型热应激蛋白的诱导表达,推测它们可能为长时间热胁迫的特异效应分子；(3)胞内83%的差异蛋白呈下调趋势,包括毒素蛋白、潜在毒素蛋白、蛋白酶以和部分基础代谢酶。蛋白的下调可能缘于胞内ClpC蛋白酶的水解,亦可能缘于细胞的严谨反应；(4)在热胁迫后期,约50%的下调蛋白恢复至正常表达量,表明此时的热胁迫细胞具有了一定的热适应性。热胁迫下Bt主要生理特性发生了如下变化：(1)ICPs和其它潜在毒力因子的表达被阻断或显著下调；(2)细胞的粘附性和运动性丧失；(3)芽胞不能形成；(4)细胞持续性地积累PHB。长时间热胁迫下Bt的生存策略如下。策略一：诱导非典型热应激蛋白以补充典型热应激蛋白的消退。非典型热应激蛋白分别参与了PHB的合成、严谨反应信号分子的合成、有毒亲电物质的消除。策略二：代谢调控。细胞将代谢维持在较低水平,以减缓代谢可能对细胞造成的氧化压力或其它负担。对代谢的调控可能是通过胞内水解酶或／和严谨反应实现。策略三：持续积累PHB。细胞在长时间热胁迫下通过代谢调整,持续积累PHB。借助PHB的抗逆性,提高细胞对热胁迫的耐受性。

全文目录


摘要  9-10
Abstract  10-12
缩略语  12-14
1 前言  14-40
  1.1 蛋白质组学研究进展  14-18
    1.1.1 蛋白质组学的产生背景和相关概念  14
    1.1.2 蛋白质组学的发展现状  14-15
    1.1.3 蛋白质组学研究的方法和技术  15-18
      1.1.3.1 样品的制备  15-16
      1.1.3.2 分离和分析  16
      1.1.3.3 蛋白点的检测  16-17
      1.1.3.4 图像分析  17
      1.1.3.5 蛋白质鉴定技术  17-18
      1.1.3.6 生物信息学分析  18
  1.2 蛋白质组学在细菌胁迫反应中的应用  18-22
    1.2.1 单因素胁迫研究  19-21
      1.2.1.1 饥饿刺激子  19
      1.2.1.2 温度刺激子  19-20
      1.2.1.3 氧化刺激子  20
      1.2.1.4 pH刺激子  20-21
      1.2.1.5 渗透压刺激子  21
      1.2.1.6 其它刺激子  21
    1.2.2 多因素胁迫研究  21-22
  1.3 热胁迫反应机制  22-30
    1.3.1 选择性应激机制  22-29
      1.3.1.1 Ⅰ型热休克基因——HrcA调节子  23-25
      1.3.1.2 Ⅱ型热休克基因——SigmaB调节子  25-27
      1.3.1.3 Ⅲ型热休克基因——CtsR调节子  27-29
      1.3.1.4 Ⅳ型热休克基因——HtpG操纵子  29
      1.3.1.5 Ⅴ型热休克基因——CssRS调节子  29
    1.3.2 非选择性应激机制  29-30
      1.3.2.1 对核糖体的抑制  29-30
      1.3.2.2 对RNA聚合酶的抑制  30
      1.3.2.3 抑制的解除  30
  1.4 芽胞杆菌 的学位论文">苏云金芽胞杆菌简介  30-38
    1.4.1 主要生理特性  31-36
      1.4.1.1 芽胞  31-34
      1.4.1.2 伴胞晶体  34-35
      1.4.1.3 其它杀虫活性物质  35
      1.4.1.4 聚β-羟基于酸(PHB)  35-36
    1.4.2 伴胞品体形成的生理生化机制  36-38
      1.4.2.1 营养因素  36-37
      1.4.2.2 代谢模式  37
      1.4.2.3 环境因素  37-38
    1.4.3 菌株YBT-1520的主要特性  38
  1.5 本课题的立题背景及研究目的  38-40
2 材料与方法  40-55
  2.1 实验材料  40-45
    2.1.1 菌株和培养基  40
    2.1.2 培养条件  40
    2.1.3 主要试剂  40-41
    2.1.4 主要试剂的配制  41-44
    2.1.5 主要仪器  44-45
  2.2 实验方法  45-55
    2.2.1 细菌形态观察  45
    2.2.2 菌数的测定  45
    2.2.3 芽胞产率的测定  45-46
    2.2.4 生长曲线的测定  46
    2.2.5 鞭毛染色实验  46
    2.2.6 运动性实验  46-47
    2.2.7 SDS-PAGE蛋白样品的制备和检测  47-48
      2.2.7.1 蛋白样品的密度定量  47
      2.2.7.2 胞内总蛋白样品的制备  47
      2.2.7.3 杀虫晶体蛋白样品的制备  47
      2.2.7.4 蛋白样品的检测——SDS-PAGE  47-48
      2.2.7.5 染色及脱色  48
    2.2.8 聚β-羟基丁酸(PHB)的检测  48-49
    2.2.9 苏云金芽胞杆菌RNA相关操作  49-51
      2.2.9.1 TRIzol法提RNA  49
      2.2.9.2 RNA的定量及质量检测  49
      2.2.9.3 RNA样品中DNA的消化  49
      2.2.9.4 RT-PCR  49-51
    2.2.10 DNA的琼脂糖凝胶电泳  51
    2.2.11 聚合酶链式反应(PCR)  51-52
    2.2.12 双向电泳蛋白样品的制备及定量  52-53
      2.2.12.1 胞内蛋白的制备及定量  52
      2.2.12.2 胞外蛋白的制备及定量  52-53
    2.2.13 双向凝胶电泳(2-DE)  53
    2.2.14 银染  53-54
    2.2.15 图像扫描及分析  54
    2.2.16 胶内酶切及MALDI-TOF/MS  54-55
3 结果与讨论  55-108
  3.1 热胁迫下菌株YBT-1520的差异蛋白质组分析  55-78
    3.1.1 双向电泳胶图概述  55-60
    3.1.2 胞内差异蛋白的质谱鉴定结果  60-64
    3.1.3 差异蛋白的功能分类(COG)  64
    3.1.4 不同时间点下差异蛋白的分布  64-66
    3.1.5 差异蛋白的表达量分析  66-75
      3.1.5.1 上调蛋白  68-70
      3.1.5.2 下调蛋白  70-75
      3.1.5.3 可恢复蛋白  75
    3.1.6 热胁迫后细胞的适应性耐受能力  75-76
    3.1.7 小结  76-78
  3.2 热胁迫对菌株YBT-1520主要生理特性的影响  78-108
    3.2.1 基本特性的变化  78-84
      3.2.1.1 生长曲线  78-79
      3.2.1.2 细胞形态变化  79-80
      3.2.1.3 细胞表面层蛋白SLP的表达差异  80-81
      3.2.1.4 鞭毛的形态变化  81-82
      3.2.1.5 鞭毛蛋白FlaA和FlaB的表达差异  82-83
      3.2.1.6 运动能力的改变  83-84
      3.2.1.7 小结  84
    3.2.2 对芽胞和ICPs的影响  84-93
      3.2.2.1 不同温度下的芽胞产率  84-85
      3.2.2.2 芽胞形成相关Sigma因子的转录差异  85-86
      3.2.2.3 芽胞形成相关Sigma因子的表达差异  86-87
      3.2.2.4 杀虫晶体蛋白的表达差异  87-88
      3.2.2.5 "60 kDa蛋白"的胰酶消化反应  88-90
      3.2.2.6 基因cry1的检测  90-91
      3.2.2.7 基因cry1和cry2的转录差异  91-92
      3.2.2.8 小结  92-93
    3.2.3 对潜在毒素蛋白和蛋白酶的影响  93-97
      3.2.3.1 潜在毒索蛋白的表达差异  93-95
      3.2.3.2 蛋白酶的表达差异  95-96
      3.2.3.3 小结  96-97
    3.2.4 对聚β-羟基丁酸(PHB)的影响  97-104
      3.2.4.1 PHB颗粒大小和形态的变化  97
      3.2.4.2 PHB颗粒表面蛋白PhaP的表达差异  97-99
      3.2.4.3 PHB含量的变化  99-100
      3.2.4.4 PHB合成代谢酶的表达差异  100-102
      3.2.4.5 PHB分解代谢酶的表达差异  102-103
      3.2.4.6 PHB持续积累的生理学意义  103-104
      3.2.4.7 小结  104
    3.2.5 热胁迫后主要生理特性的恢复  104-108
      3.2.5.1 恢复生长时的细胞形态  104-106
      3.2.5.2 不同热胁迫下ICPs的表达差异  106-107
      3.2.5.3 小结  107-108
4 总结与展望  108-111
  4.1 总结  108-109
  4.2 展望  109-111
参考文献  111-126
攻读博士期间发表和待发表的论文  126-127
致谢  127

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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