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结直肠癌外周血肿瘤细胞定量检测方法的建立及临床意义

作　者: 汪彬哲
导　师: 胡伟民
学　校: 广州医学院
专　业: 肿瘤学
关键词: 结直肠癌 循环肿瘤细胞 人端粒酶逆转录酶 免疫磁化分选技术 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:建立联合应用免疫磁化分选技术和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应定量检测循环肿瘤细胞的方法,并探讨其定量检测结直肠癌患者外周血肿瘤细胞的临床意义。方法:体外培养结肠癌HCT-116细胞,将其分为101-106共6个不同数量等级,分别与5ml健康人外周静脉血混合,采用密度梯度离心法分离其外周血单个核细胞。分离后的细胞标本分为免疫磁珠富集组(A组)和非富集组(B组),另分别设置阴性对照组。A组及对应的阴性对照组与包被单克隆抗体CD326的免疫磁珠作用,经免疫磁珠分选器分离富集后,提取富集分选标本的总RNA。B组及对应的阴性对照组未经免疫磁珠富集处理,直接提取其总RNA。A和B组标本的总RNA采用实时荧光定量RT-PCR方法检测其中的人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达水平,各组分别进行10次实验,统计分析检测结果,进行对照实验研究,建立灵敏度更高的循环血肿瘤细胞检测方法。抽取22例初治的结直肠癌患者和22例健康人外周静脉血,采用密度梯度离心法分离其外周血单个核细胞。22例患者的外周血单个核细胞标本分为免疫磁珠富集组(C组)和非富集组(D组),22名健康者外周血单个核细胞标本设为E组。提取其总RNA后采用RT-PCR方法检测其hTERT-mRNA的表达水平,比较三组检测结果,探讨联合应用免疫磁化分选技术和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应定量检测结直肠癌外周血肿瘤细胞的临床意义。结果:(1)细胞实验中所有阴性对照组PCR扩增曲线均呈不规则的波浪线,未出现典型的S型扩增曲线,表明所有阴性对照组标本均未出现特异性PCR扩增;(2)A组和B组10次实验101-106各数量级细胞组的PCR扩增Ct值均数见表五;经相对定量后比较10次实验101-106各数量级细胞组hTERT-mRNA的表达水平,A组显著高于B组,结果具有统计学意义(P<0.05),见表六;(3)22例结直肠癌患者中,C组和D组的PCR扩增Ct值见表七;经相对定量后比较22例标本中两组hTERT-mRNA的表达水平,C组显著高于D组,结果具有统计学意义(P<0.05),见表八;(4)经相对定量比较结直肠癌患者和健康者hTERT-mRNA的表达水平,C显著高于E组,结果具有统计学意义(P<0.05),见表九;(5)C组中,22例结直肠癌患者hTERT-mRNA的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位和肿瘤浸润深度无明显相关,结果无统计学意义(P>0.05)。与患者有无淋巴结转移和TNM分期情况呈明显相关,结果具有统计学意义(P<0.05),见表十。结论:经实验研究建立的联合应用免疫磁化分选技术和RT-PCR的检测方法,通过测定hTERT-mRNA的表达水平可定量检测外周血肿瘤细胞,检测灵敏度优于单纯使用RT-PCR的检测方法。结直肠癌患者外周血hTERT-mRNA的表达水平与淋巴结转移和TNM分期呈明显相关,为临床早期发现结直肠癌患者微转移提供新的思路。进一步深入研究,对结直肠癌患者的诊断、治疗及预后的判断等方面均有较大的临床应用价值。

全文目录


缩略词表  3-4
中文摘要  4-6
Abstract  6-9
前言  9-13
材料与方法  13-20
  1)材料  13-14
  2)方法  14-20
结果  20-23
  一、 方法学的建立  20
  二、临床病例组与健康者对照组实验方法  20-23
讨论  23-27
结论  27-28
参考文献  28-31
附图  31-36
综述  36-44
  参考文献  42-44
致谢  44-46

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肠肿瘤
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