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MYH基因变异与结直肠癌易感性关系的初步研究

作　者: 杨柳
导　师: 周建农
学　校: 南京医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: MYH(MutY homologue,人同源性MutY基因) MAP(MYH-associated polyposis,MYH相关性息肉病) 变异结直肠癌
分类号: R735.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景:MYH基因是一个碱基切除修复（Base Excision Repair, BER）基因,定位于lp32.1-lp34.3,其16个外显子共有164lbp （GenBank # NM₀12222.1）。MYH蛋白,即MYH转葡糖基酶编码535个氨基酸,存在于细胞核和线粒体内,主要作用是在DNA复制完成后切除新生链中与母链被活性氧簇（Reactive Oxygen Species,ROS）损伤的产物8-oxodG（8-oxo-7,8-dihydroguanine, 8-氧-脱氧鸟苷）所形成错配的腺嘌呤。野生型MYH纯合型变异可引发一种常染色体隐性遗传病,称为MYH相关性息肉病（MYH-associated polyposis,MAP）。与其类似的息肉病有经典型家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis,CFAP）、减弱性家族性腺瘤性息肉病（attenuated familial adenomatous polyposis, AFAP）,以及Peutz–Jeghers综合征（Peutz–Jeghers syndrome, P-J综合征）,后三者为常染色体显性遗传病。MAP的其发生机制是由BER系统、错配修复（Mismatch Repair,MMR）系统、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）等相互作用、共同参与的。MYH杂合型变异也可导致结直肠癌的产生,而且具有遗传易感性,亲代均为杂合型变异者,其后代理论上有25%的概率可能成为MAP患者。目的:MYH（MutY homologue）基因杂合性变异（除特殊说明之外,本研究中的变异均为杂合性变异）可能会增加结直肠癌的发病风险。采取相应措施如相关基因的检测,有助于发现高危人群做到早发现、早诊断和早治疗。设计本实验试图探讨MYH基因杂合性变异与结直肠癌易感性之间的关系,服务临床。方法:抽取140例大肠癌患者及280名正常对照人群的外周血,然后提取所抽取外周血的DNA,进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）,重点扩增MYH基因16个外显子区域中高频变异的7个区域,即Exon 1、Exon 7、Exon 9、Exon 11、Exon 13、Exon 14、Exon 16。再经过变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC）筛查出流出峰异常的变异样本,最后利用DNA测序技术对变异进行验证确认,用SPSS（v. 13. 0）统计软件进行数据分析。结果:（1）通过实验筛查出以下几个外显子区域存在变异1) Exon 1区域的变异为Exon1-316 G>A、Exon1-292 G>A和Intron1+11 C>T,这三个位点在病例组和对照组的变异样本中均同时出现,病例组变异危险性均是对照组的8.21倍（p=0.04;OR=8.21,95%CI为1.63—41.22）,详见表3。统计数据与文献报道中关于MYH杂合性变异的数据较为吻合,OR值均在2至10之间,表明此变异可能会增加结直肠癌的发病风险。2) Exon16区域筛查出一种全新的缺失变异为nt 1678-80 del GTT,病例组中直肠癌患者的变异危险性为结肠癌患者的7.26倍（p=0.04, OR=7.26,95%CI为1.17—45.27）,详见表4。这一点对于手术方式的选择,保肛与否以及评判患者预后有一定指导意义。3) Exon 14区域筛查出1种错义变异,即Exon14+74 T>A,p.V463E,是本研究所筛查出的唯一错义变异,在人类基因突变数据库（ HGMD, http://www.hgmd.cf.ac.uk/）中未见收录,电中性的缬氨酸被正电性的谷氨酸所取代,可能会导致蛋白质的极性和结构发生改变,期待在后续研究中能够得到深入的探讨。4) Exon 11区域和Exon 13区域各筛查出一个变异,位点分别为Intron10-2 A>G和Intron13+12 C>T,两个区域病例组与对照组的变异危险性均无显著性差异。（2） Exon 11和Exon 16两个区域的筛查结果。首先,将这两个外显子区域的病例组及对照组的年龄进行配对t’检验（比较前已进行正态性检验及方差齐性检验）,组间平均年龄均无统计学差异（p>0.5）。将这两个外显子区域的病例组变异者年龄和对照组变异者年龄进行配对t检验（检验前已作正态性检验及方差齐性检验）,发现两个外显子区域中病例组突变者的平均年龄均显著高于各自对照组变异者的平均年龄,统计结果分别为（t=4.91,p<0.0005）和（t=9.31,p<0.0005）。而将这两个外显子区域的病例组非变异者的年龄与各自对照组非变异者的年龄进行配对t’检验（检验前已作正态检验及方差齐性检验）,结果均无显著性意义（p>0.1）,详见表5。上述统计结果提示对照组变异者在若干年后也有癌变的可能性。与文献中关于MYH基因变异后结直肠癌变年龄晚,癌变风险高的报道相一致,纯合性MYH变异所致的MAP这样的发病特点更为明显,癌变率非常高。尽管无法排除高龄是肿瘤的易感因素,但此结果仍提示对MYH变异筛查监测有积极意义。（3） Exon 16区域的筛查结果还提示性别间变异率在本底水平存在差异,在病例组中,男女性之间变异率差异有统计学意义,男性的变异频率比女性高（p=0.04）,对照组中男性变异频率也显著高于女性（p=0.03）,病例组男性与对照组男性之间的变异率差异无统计学意义（p>0.1）,两组女性之间变异率差异也无统计学意义（p>0.1）,详见表6。可见这种差异与致病性无关,结合BER系统的相关文献报道推测其原因原因可能与BER系统本身有关。（4） Exon 11的变异Intron10-2 A>G已被证实会导致mRNA异常,最终使的MYH蛋白缩短,而无法在细胞核内正常定位。筛查出的其他位点存类似变异,但是否会引起功能改变仍须作进一步研究。（5）在Exon 7区域及Exon 9区域两个外显子区域中没有筛查出任何变异,Exon 7区域是高加索人种中变异频率最高的一个外显子区域,该结果结合各地文献报道,提示人种间变异可能存在差别。结论:MYH杂合性变异可能会增加结直肠癌的发病风险;部分可能的分子机制已被证实,即通过对剪接、转录过程的影响最终使MYH蛋白发生改变;或者使MYH蛋白的翻译效能下降等。但是基因变异诱发肿瘤的过程非常复杂,要最终明确MYH基因变异如何促使结直肠癌的发病风险增加,仍需进行大量蛋白水平的探讨。没有筛查到高加索人群中最常见的Exon 7区域的变异,提示人种间变异可能存在差别;MYH变异筛查并进行长期监测管理,在结直肠癌的预防、诊断、治疗以及预后方面有一定的指导意义。

全文目录

中文摘要  5-9
Abstract  9-13
前言  13-52
  1. 研究背景  16-17
  2. 实验材料  17-20
    2.1 标本来源  17
    2.2 实验仪器  17-18
    2.3 实验试剂  18-19
    2.4 试验器具的处理和准备  19
    2.5 试剂的配制和准备  19-20
  3. 实验方法  20-30
    3.1 抽提总DNA的操作流程  20
    3.2 电泳检测  20-21
    3.3 电泳结果  21
    3.4 PCR反应  21-23
    3.5 电泳  23-24
    3.6 变性高效液相色谱（DHPLC）分析  24-26
    3.7 PCR产物测序验证  26-29
    3.8 统计分析  29-30
  4. 结果  30-41
    4.1 MYH基因外显子区域变异情况筛查结果  30-32
    4.2 MYH基因外显子区域变异情况分析结果  32-41
  5. 讨论  41-47
  6.结论  47-52
    6.1 筛查出以下几个外显子区域存在变异  48
    6.2 两个变异频率较高区域的分析  48-49
    6.3 Exon 16 区域变异情况的本底性别差异  49
    6.4 其他外显子区域变异情况分析  49-52
参考文献  52-57
综述  57-77
  参考文献  65-77
附录  77-78
在校期间完成的论文  78-79
致谢  79

MYH基因变异与结直肠癌易感性关系的初步研究

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