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利用RNAi技术探讨酸感受离子通道（ASICs）的特性

作　者: 靳庆娥
导　师: 郑建全
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 分子药理学
关键词: ASICs RNA干扰 shRNA C6 pH
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


酸感受离子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）是H+门控的阳离子通道，在胞外H+浓度增高时激活开放，胞外Na+通过其开放的通道进入胞内，导致细胞去极化兴奋。ASICs通道属于表皮钠通道／退化因子基因（ENaC／DEG，epithelial sodium channel／degenerin gene）超家族的一员，到目前为止，已克隆了由4个基因编码的6个不同亚基，它们分别是：ASIC1a，ASIC1b，ASIC2a，ASIC2b，ASIC3和ASIC4。其中，ASIC1a是一个很重要的亚基，它在突触传递及其可塑性的调节、空间学习记忆、长时程增强（LTP）、痛觉传导和缺血性脑损伤等生理和病理活动中起重要作用。组织酸化是一个很常见的病理现象，如脑卒中，癫痫发作，炎症，肿瘤组织和代谢异常等都会引起局部组织的酸化进而组织损伤。以往实验结果表明ASIC1a参与了酸化诱导神经元损伤的过程，在电压门控性Ca2+通道和谷氨酸受体阻断剂存在的情况下，ASIC1a激活随之胞内Ca2+超载能引起时间依赖的神经损伤，并可被ASIC1a特异性阻断剂（PcTX1）或降低胞外Ca2+所抑制。为了进一步探索抑制ASICs与酸化诱导损伤的关系，本研究采用了以ASIC1a基因为靶点的RNAi（RNA interference）技术，旨在观察敲减ASIC1a亚基表达后可能的抗酸性神经保护作用。本实验首先通过RT-PCR法确证了ASICs各亚基在大鼠神经胶质瘤C6细胞，大鼠海马神经元和DRG神经元中的表达。然后利用RNAi技术构建了针对ASIC1a和ASIC2a亚基的shRNA表达载体，经western blotting筛选出有效的干扰质粒。随后建立了稳定敲减ASIC1a表达的细胞株和稳定阴性对照细胞株，经半定量RT-PCR和western blotting证实了稳定株中ASIC1a的敲减效果。通过绘制细胞生长曲线和测集落形成率的实验发现：抑制ASIC1a亚基的表达未改变正常情况下细胞的生长增殖情况。通过MTT实验和LDH释放实验发现在不同酸性条件下（pH6.0，pH6.5，pH6.9）抑制ASIC1a亚基的表达能显著减轻酸化诱导的损伤反应：细胞存活数目明显增多，生存状态也有所改善。LDH释放实验发现在大鼠海马神经元上转染pshRNA1a2干扰质粒抑制ASIC1a亚基表达后，能显著减轻pH6.0酸性条件下神经元的损伤，这与C6细胞上得到的实验结果相一致。为了探索ASIC1a亚基的敲减是否是细胞抗酸性损伤的主要原因，在实验中我们对比了加入氨氯吡咪（amiloride）与抑制ASIC1a亚基表达对pH6.0损伤保护作用的差异，结果发现：它们的保护作用相当，差异无显著性意义。为了初探C6细胞上抑制ASIC1a亚基表达抗酸性损伤的机制，我们首先证明了C6细胞上有可通透Ca2+的被酸激活的通道，然后比较了在pH6.0条件下胞外Ca2+从0.2mM上升到1.3mM时对shRNA1a2（2）和shNEG细胞的影响。结果显示，酸化能引起两组细胞的损伤，但shRNA1a2（2）与shNEG组相比，损伤程度有所减轻，细胞死亡数目明显减少。以上研究显示，敲减ASIC1a亚基表达能显著降低酸化诱导的细胞损伤，ASIC1a亚基的敲减可能是细胞耐酸性的主要原因，这为新的脑神经元保护策略提供了思路和实验依据。

全文目录


中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
英文缩写  9-10
前言  10-14
第一章 稳定敲减ASICla基因表达的C6细胞抗酸特性的观察  14-43
  实验材料  14-18
  实验方法  18-32
  实验结果  32-43
    1.C6细胞中ASICs各亚基的表达  32-33
    2.构建shRNAla干扰质粒序列鉴定结果  33-34
    3.shRNA对C6细胞中ASICla蛋白量的影响  34-36
    4.shRNAla2对C6细胞中ASICla mRNA量的影响  36
    5.shRNAla2对C6细胞增殖活力的影响  36-37
    6.shRNAla2对C6细胞集落形成能力的影响  37-38
    7.shRNAla2对酸性条件下C6细胞活力的影响  38-39
    8.shRNAla2对酸性条件下C6细胞损伤的影响  39-40
    9.氨氯吡咪(Amiloride)孵育不同时间对C6细胞的影响  40
    10.shRNAla2与Amiloride对C6细胞抗酸保护作用的比较  40-41
    11.[Ca~(2+)]_o的不同浓度对酸化条件下shRNAla2(2)和shNEG细胞的影响  41-43
第二章 shRNAla2对大鼠海马神经元抗酸保护作用的观察  43-50
  实验材料  43-44
  实验方法  44-46
  实验结果  46-50
    1.ASICs在大鼠海马神经元中的表达  46
    2.shRNAla2对大鼠海马神经元的抗酸保护作用  46-47
    3.构建shRNA2a干扰质粒序列鉴定结果  47-48
    4.shRNA2a干扰质粒有效性的检测  48-49
    5.ASICs在大鼠DRG中的表达  49-50
讨论  50-60
结论  60-61
参考文献  61-66
致谢  66-67
综述  67-73
个人简历  73

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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