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酸敏感离子通道在心肌上的表达和分布及其电生理特性

作　者: 宋建人
导　师: 陈建国
学　校: 华中科技大学
专　业: 药理学
关键词: 心肌组织心肌细胞 ASICs 原代培养心室肌细胞 TRPV1 急性分离心室肌细胞
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

第一部分ASICs mRNA和蛋白在心脏组织和心室肌细胞上的表达目的:探讨心肌组织和心肌细胞上是否有ASICs的表达。方法:应用SD大鼠的心肌组织和心室肌细胞,采用RT-PCR, Western bloting,和免疫荧光的方法,观察酸敏感离子通道在心肌组织和心室肌细胞基因和蛋白的表达和分布情况。结果:ASICs mRNA和蛋白在心脏组织和心室肌细胞上有表达。1. RT-PCR结果表明在心脏组织中存在ASIC1, ASIC2a和ASIC3的mRNA的表达。其基因片段碱基数分别为140bp, 139bp,和107bp。2. Western Blotting结果提示在心脏组织和培养心室肌细胞上均有ASIC1, ASIC2a和ASIC3蛋白的表达。其中,心肌组织中的ASICs总量明显多于心肌细胞;与神经组织上的ASICs一致,三种ASICs蛋白印迹的具体位置是均在55~72kDa之间,其中ASIC1的分子量稍大,ASIC2a和ASIC3相似。3.免疫荧光标记在心脏组织和培养心室肌细胞上均有ASIC1, ASIC2a和ASIC3蛋白的表达。从荧光密度上看,三种亚单位的表达强度并无明显区别,但其分布并不完全一致。ASIC1大部分分布于心肌细胞核内,仅少量分布于胞浆和胞膜上;ASIC2a大部分分布于胞核,但也有相当的数量分布于胞浆和胞膜; ASIC3则正好相反,大部分分布于胞膜和胞浆,少量分布于胞核。不同亚单位(ASIC1,ASIC2a以及ASIC3)在胞浆和胞膜的荧光密度分别为:32.01±5.98 (n=8); 21.83±4.83 (n=10)和12.43±3.46 (n=11)。结论:1. RT-PCR结果表明在心脏组织中存在ASIC1, ASIC2a和ASIC3的mRNA的表达。2.免疫荧光和Western Blotting证明在心脏组织和培养心室肌细胞上均有ASIC1, ASIC2a和ASIC3蛋白的表达,并且三者分布各有特点。第二部分原代培养心肌细胞上酸引发的电流目的:研究心肌细胞上ASICs通道的功能和电生理学特性。方法:在原代培养的心室肌细胞上采用全细胞膜片钳技术记录酸引发的电流。结果:在所有细胞中,对酸有反应的细胞比例是75.34%,其中ASICs样电流所占比例是43.83%,TRPV1样电流所占比例是34.25%,部分细胞两种电流都存在。1.在大鼠心室肌细胞上存在酸引发的ASICs样电流(1) ASICs样电流可以被阿米洛利(100μM)可逆性阻断,并且发现几乎所有类型的ASICs样电流均存在于培养的心肌细胞上,包括ASIC1a,ASIC1b,ASIC2a和ASIC3,也不排除各种亚基以异聚体通道的形式出现。(2)当pH7.0时,便可以引发出ASICs样电流。所引发的ASICs样电流具有PH值依赖性,电流密度-pH曲线呈倒“S”型,pH从6.0到5.0之间有一个较大的跳跃。统计结果显示:pH7.0时,ASICs电流密度为8.51±4.37 pA/pF (n=8);pH6.0时,ASICs电流密度为17.03±5.02 pA/pF (n=11);pH5.0时,ASICs电流密度为50.20±6.94 pA/pF (n=7);pH4.0时,ASICs电流密度为53.73±9.87 pA/pF(n=7)。经Hill方程拟合,其pH50为5.73±0.18。该pH50值与ASIC1b(约为5.9)相近。2.在大鼠心室肌细胞上存在酸引发的TRPV1样电流TRPV1样电流可以被20μM的CPZ可逆性阻断,并且具有pH值依赖性。在pH6.0的条件下,培养心室肌细胞上TRPV1的电流密度是9.52±4.89pA/pF (n=5)。结论:1.大鼠原代培养的心室肌细胞上存在两种酸引发的电流。一种是瞬时的,可以被阿米洛利可逆性阻断,可能为ASICs样电流;另外一种是持续性的,可以被CPZ可逆性阻断,可能为TRPV1样电流。2.在原代培养的心室肌细胞上记录到的ASICs样电流,经Hill方程拟合,其pH50大约是5.73。与ASIC1b的pH50 5.9最接近,所以推断电流成分中ASIC1b可能占优势,但是其它电流也是存在的,其中可能有相当量的ASIC2a,ASIC3。第三部分急性分离心室肌细胞上酸引发的电流目的:为了进一步研究急性分离心室肌细胞上ASICs通道的电生理特点,并与培养心肌细胞比较。方法:在急性分离的大鼠心室肌细胞上采用全细胞膜片钳技术记录酸引发的电流。结果:所有细胞中,对酸的反应率是84.62%,ASICs样电流所占比例是61.54%,TRPV1样电流所占比例是23.08%,其中有部分细胞同时存在两种电流。1.在大鼠急性分离的心室肌细胞上存在酸引发的ASICs样电流,并记录到三种ASICs样电流。ASICs样电流可以被100μM的阿米洛利可逆性阻断,pH6.0时ASICs的电流密度为9.22±5.19 pA/pF (n=5)。2.在大鼠急性分离的心室肌细胞上存在酸引发的TRPV1样电流。TRPV1样电流可以被20μM的CPZ可逆性阻断,pH6.0时,TRPV1的电流密度是1.69±0.26 pA/pF (n=3)。结论:成年大鼠急性分离心室肌细胞上存在两种酸引发的电流,一种是瞬时的,可以被阿米洛利可逆性阻断,可能为ASICs样电流;另外一种是持续性的,可以被CPZ可逆性阻断,可能为TRPV1样电流。全文总结:1. ASICs mRNA和蛋白在心脏组织和心室肌细胞上有表达,并且三种亚型分布均有特点。2.大鼠原代培养的心室肌细胞上存在两种酸引发的电流,两种类型的电流,一种是瞬时的,可以被阿米洛利可逆性阻断,可能为ASICs样电流;另外一种是持续性的,可以被CPZ可逆性阻断,可能为TRPV1样电流。总细胞反应率是75.34%,ASICs样电流比例是43.83%,TRPV1样电流比例是34.25%,部分细胞上两种电流都存在。3.成年大鼠急性分离心室肌细胞上存在两种酸引发的电流,一种是瞬时的,可以被阿米洛利可逆性阻断,可能为ASICs样电流;另外一种是持续性的,可以被CPZ可逆性阻断,可能为TRPV1样电流。在所有细胞中,对酸的反应率是84.62%,ASICs电流所占比例是61.54%,TRPV1电流所占比例是23.08%,其中有部分细胞同时存在两种电流。

全文目录

缩略词表  5-6
摘要  6-10
Abstract  10-14
前言  14-20
第一部分 ASICs m RNA 和蛋白在心肌组织和心肌细胞上的表达  20-34
  1 材料与方法  20-24
  2 结果  24-31
  3 讨论  31-32
  参考文献  32-33
  小结  33-34
第二部分原代培养心肌细胞上酸诱发的电流  34-47
  1 材料与方法  34-37
  2 结果  37-43
  3 讨论  43-44
  参考文献  44-46
  小结  46-47
第三部分急性分离心肌细胞上酸引发的电流  47-54
  1 材料与方法  47-49
  2 结果  49-51
  3 讨论  51-52
  参考文献  52-53
  小结  53-54
全文总结  54-56
综述  56-71
  References  64-71
硕士期间待发表的文章  71-72
致谢  72

酸敏感离子通道在心肌上的表达和分布及其电生理特性

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