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小菜蛾APN和Pxbre基因的克隆与mRNA表达

作　者: 包宏伟
导　师: 杨亦桦
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 小菜蛾 Cry1Ac 氨肽酶糖脂糖基转移酶 mRNA表达
分类号: S433.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 3次
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内容摘要

小菜蛾(Plutella xylostella L.)的生殖周期短、繁殖量大、适应性广,是世界性分布的重要农业害虫,也是产生抗药性最严重的害虫之一。苏云金杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)内毒素是一种杀虫特异性高、对脊椎动物安全的杀虫蛋白,广泛用于对小菜蛾的防治。由于其长期使用,已经在部分地区发现了小菜蛾对Bt制剂产生了严重抗性。为了使这一环境友好型杀虫剂能长期使用,有必要研究清楚其抗性机理。目前对小菜蛾抗性机理已经在生化和分子水平上做了一些基础研究,但没有明确的结论。本文对可能与抗性相关的小菜蛾4个Pxbre新基因进行了克隆,并比较了APN, ALP及bre2-like等15个基因在小菜蛾CrylAc抗性和敏感品系中的mRNA表达水平。1.小菜蛾9个APN基因和1个ALP基因mRNA表达水平的比较昆虫中肠氨肽酶APN和碱性磷酸酯酶ALP表达量可能与Bt毒素抗性相关。本研究利用半定量PCR比较了9个氨肽酶APN基因和1个碱性磷酸酯酶ALP基因在小菜蛾CrylAc抗性和敏感品系四龄幼虫中肠间的mRNA相对表达量,发现它们之间没有显著差异。推测小菜蛾对Cry1Ac毒素的抗性可能与这几个基因的mRNA表达量无关。2.小菜蛾Pxbre基因的克隆、序列分析和在小菜蛾CrylAc抗性和敏感品系中mRNA表达水平的比较在线虫中,Bt毒素与中肠BBMV上糖脂受体结合后导致孔洞的形成、线虫的死亡；在昆虫中也有证据表明Bt毒素能与糖脂受体结合。根据线虫中4个bre基因及其同源基因的保守序列设计简并引物,利用RT-PCR扩增出小菜蛾中与线虫bre基因同源的cDNA片段,再用RACE技术获得了4个基因的全长cDNA,分别命名为Pxbre-1、Pxbre-3、Pxbre-4、Pxbre-5、序列比对分析发现,这些基因和线虫中相应的基因序列具有较高的相似性,且具有相同的氨基酸保守模块,推测所克隆的基因和对应的线虫bre基因有着类似的功能。比较小菜蛾Cry1Ac抗性、敏感品系4个Pxbre基因的氨基酸序列,发现两个品系间存在多个氨基酸多态性位点,但是在抗性品系中没有发现特异性的氨基酸替换。在抗性品系中发现Pxbre-3基因的一个克隆中存在一个插入突变,经过与基因组序列比对,表明该插入序列是由于该段中的内含子未被剪切。该插入突变可以导致氨基酸翻译被提前终止,但该突变是否与抗性有关需要进一步研究。通过定量PCR技术检测了5个Pxbre基因在小菜蛾四龄幼虫、蛹、成虫中的mRNA相对表达量,发现这5个基因都是在成虫中表达量最高。小菜蛾Cry1Ac抗性、敏感品系四龄幼虫中肠之间,Pxbre-1、Pxbre-4和Pxbre-5在抗性品系中表达量较高,而Pxbre-2(bre2-like)和Pxbre-3在敏感品系中表达量较高。

全文目录

摘要 6-8ABSTRACT 8-10缩略词 10-11第一章文献综述 11-27 1 BT毒素作用机理及靶标昆虫的抗性机理 11-18 1.1 苏云金芽孢杆菌简介 11-12 1.2 Bt毒素的作用机制 12-14 1.3 昆虫对Bt毒蛋白的抗性机制 14-18 2 糖类及其与BT抗性的关系 18-25 2.1 鞘糖脂类化合物的研究背景 19-20 2.2 糖脂中糖链的合成 20-21 2.3 糖类与Bt抗性关系的研究 21-25 3 本研究的内容及意义 25-27第二章小菜蛾 Cry1Ac抗性和敏感品系APN基因和ALP基因mRNA表达量的比较 27-35 1 材料和方法 28-31 1.1 供试昆虫 28 1.2 主要试剂 28 1.3 主要仪器 28 1.4 总RNA的提取 28-29 1.5 第一链cDNA的合成 29-30 1.6 引物的设计 30-31 1.7 半定量PCR扩增条件 31 2 结果与分析 31-32 3 讨论 32-35第三章小菜蛾Pxbre基因的克隆、序列分析及在抗性和敏感品系中mRNA表达水平的比较 35-63 1 试验材料 37-38 1.1 供试昆虫 37 1.2 主要试剂 37-38 2 试验方法 38-43 2.1 总RNA和基因组DNA的提取 38 2.2 小菜蛾Pxbre基因cDNA片段的克隆 38-41 2.3 小菜蛾Pxbre-基因RACE克隆 41-42 2.4 小菜蛾Pxbre基因全长的验证 42 2.5 小菜蛾Pxbre基因与同源基因的氨基酸序列比较分析 42 2.6 小菜蛾Pxbre基因氨基酸序列在抗、敏品系间的比较分析 42 2.7 小菜蛾Pxbre基因mRNA的相对表达量的研究 42-43 3 结果与分析 43-59 3.1 小菜蛾Pxbre基因全长的获得和氨基酸序列分析 43-48 3.2 小菜蛾Cry1Ac抗性和敏感品系间Pxbre基因的氨基酸序列比较 48-54 3.3 小菜蛾Pxbre基因mRNA的相对表达量的研究 54-59 4 讨论 59-63全文总结 63-65参考文献 65-79致谢 79

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