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Ⅰ型菌毛介导鼠伤寒沙门氏菌对小鼠的毒力及对抗原递呈细胞侵袭力的研究

作　者: 张成栋
导　师: 郭爱珍
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: Ⅰ型菌毛 鼠伤寒沙门氏菌 抗原递呈细胞 毒力 侵袭力 基因芯片
分类号: S855.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enteria serovar Typhimurium）为肠杆菌科沙门氏菌属成员,是条件性细胞内寄生的革兰氏阴性肠杆菌,具有广泛的宿主感染谱,如小鼠、家禽、猪、羊、牛、马和人,能引起人和动物的沙门氏菌病,具有重要的公共卫生意义。沙门氏菌菌毛是细菌表面的纤细结构,与细菌粘附上皮细胞及在小肠粘膜定植有关。Ⅰ型菌毛是静止培养时唯一表达的菌毛,其结构与功能是各种菌毛中研究最为清楚的一种。前期体外研究证明,沙门氏菌Ⅰ型菌毛与细菌粘附与侵袭宿主细胞有关。本研究在此基础上,以小鼠为模型,进行体内研究,通过LD50与侵袭试验,证实鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛对细菌毒力和侵袭的影响。本研究针对沙门氏菌Ⅰ型菌毛,主要进行以下几个方面的研究:1.以鼠伤寒沙门氏菌SR-11衍生株AJB3为参考菌株,三重突变的重组鼠伤寒沙门氏菌AJB3fim-lpfinvA-（标记为117#）和稳定表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ44-h及不表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ33-h为对照菌株进行粘附细胞能力的研究。结果表明:三重突变的重组沙门氏菌AJB3fim-lpfinvA-粘附HEp-2细胞和体外培养的骨髓源DC的能力显著下降,说明突变株构建成功;稳定表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ44-h比不表达Ⅰ型菌毛重组鼠伤寒沙门氏菌117#-pAZ33-h粘附HEp-2细胞和体外培养的骨髓源DC的能力显著升高,而且比野生性菌株的粘附能力略有增加,说明Ⅰ型菌毛特异性介导鼠伤寒沙门氏菌粘附上皮细胞和骨髓源树突状细胞。2.通过灌胃和尾静脉注射两种方法接种小鼠进行动物试验,探索Ⅰ型菌毛体内对鼠伤寒沙门氏菌的毒力及侵袭力的影响。研究结果表明:灌胃攻毒小鼠时,Ⅰ型菌毛能明显降低细菌的毒力,两者LD50相差42倍。细菌117#-pAZ33-h在各器官的菌量多于细菌117#-pAZ44-h,细菌在体内扩散途径是首先在肠Peyer结定植,然后经肠系膜淋巴结,最后到脾脏的途径在体内扩散。在脾脏中,树突状细胞能特异性结合表达Ⅰ型菌毛的重组细菌,而单核-巨噬细胞对细菌的识别没有选择;鼠伤寒沙门氏菌通过尾静脉侵袭小鼠时,表达Ⅰ型菌毛的重组鼠伤寒沙门氏菌毒力比不表达Ⅰ型菌毛的重组鼠伤寒沙门氏菌要强,两者LD50相差19倍。细菌117#-pAZ44-h在各器官的菌量多于细菌117#-pAZ33-h,细菌在体内扩散途径与灌胃时相反。在脾脏中,树突状细胞能特异性结合表达Ⅰ型菌毛的重组细菌,并且其感染水平随细菌增殖而升高。单核-巨噬细胞对细菌的识别没有选择性,并且被活化后一直保持在相对稳定感染水平。表达Ⅰ型菌毛能特异性介导细菌对B细胞的侵袭,但随着体液免疫活性的降低,B细胞感染率下降。3.用小鼠全基因组芯片（32256个基因）,对两株细菌刺激小鼠骨髓源树突状细胞60min后基因表达谱进行检测。以117#-pAZ33-h（fim-）刺激组基因差异表达谱为参照,对117#-pAZ44-h（fim+）刺激组基因差异表达基因进行归类分析,表达Ⅰ型菌毛的重组鼠伤寒沙门氏菌使细胞基因表达下调为主;差异表达的基因主要集中在蛋白质代谢相关基因、转录翻译等与细胞增殖相关基因和信号转导相关基因,分别占到差异表达基因总数的24.1%、21.6%和13.8%;说明沙门氏菌刺激细胞时,通过抑制一系列相关基因表达而降低其免疫活性。总之,本研究阐明了沙门氏菌Ⅰ型菌毛对细菌体内毒力及对抗原递呈细胞的侵袭力的影响,从而为设计更加安全高效的弱毒沙门氏菌疫苗载体及有效防制人畜重要传染病提供了理论与实验依据。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略语表(Abbreviation)  12-13
第1章 文献综述  13-24
  1.1 沙门氏菌致病性的研究  13-14
  1.2 沙门氏菌的菌毛  14-18
    1.2.1 沙门氏菌菌毛分类  14-16
    1.2.2 菌毛在沙门氏菌致病中的作用  16-17
    1.2.3 菌毛抗原的应用  17-18
  1.3 抗原递呈细胞介导的沙门氏菌感染与免疫  18-23
    1.3.1 抗原递呈细胞  18-21
    1.3.2 抗原递呈细胞在沙门氏菌感染中的作用  21-23
  1.4 研究目的及意义  23-24
第2章 鼠伤寒沙门氏菌突变株体外粘附的研究  24-40
  2.1 实验材料  24-26
    2.1.1 菌株和细胞  24-25
    2.1.2 实验动物及相关试剂  25
    2.1.3 主要试剂及溶液的配制  25-26
  2.2 实验方法  26-30
    2.2.1 实验所需质粒的制备  26-27
    2.2.2 重组鼠伤寒沙门氏菌的培养  27-28
    2.2.3 细菌的计数  28
    2.2.4 细胞的培养  28-29
    2.2.5 细菌粘附HEp-2细胞  29
    2.2.6 细菌粘附BMDC  29-30
    2.2.7 粘附BMDC的LSCM观察  30
    2.2.8 粘附BMDC的ESEM观察  30
  2.3 结果与分析  30-37
    2.3.1 细菌玻片凝集实验  30-31
    2.3.2 细菌黏附HEp-2细胞FACS  31-33
    2.3.3 细菌黏附BMDC的FACS  33-35
    2.3.4 LSCM观察结果  35-36
    2.3.5 ESEM观察结果  36-37
  2.4 讨论  37-38
    2.4.1 细菌的培养及鉴定  37-38
    2.4.2 细菌粘附细胞  38
  2.5 小结  38-40
第3章 Ⅰ型菌毛在口服感染中对细菌毒力及侵袭力影响  40-53
  3.1 实验材料  41-42
    3.1.1 菌株  41
    3.1.2 实验动物及相关试剂  41
    3.1.3 主要试剂及溶液的配制  41-42
  3.2 试验方法  42-44
    3.2.1 细菌的培养  42
    3.2.2 细菌的计数  42-43
    3.2.3 细菌对小鼠的急性毒性实验  43
    3.2.4 细菌在小鼠体内各器官的动态分布  43
    3.2.5 小鼠脾脏细胞中APC感染率的检测  43-44
  3.3 结果与分析  44-50
    3.3.1 细菌对小鼠急性毒性实验  44-46
    3.3.2 细菌在小鼠体内各器官的动态分布  46-48
    3.3.3 细菌对脾脏DC和M(?)的侵袭力  48-50
  3.4 讨论  50-52
    3.4.1 细菌在小鼠体内各器官的分布  50-51
    3.4.2 细菌对脾脏DC和M(?)的侵袭力  51-52
  3.5 小结  52-53
第4章 Ⅰ型菌毛在静脉注射感染中对细菌毒及侵袭力影响  53-64
  4.1 实验材料  53-55
    4.1.1 菌株  53
    4.1.2 实验动物及相关试剂  53
    4.1.3 主要试剂及溶液的配制  53-55
  4.2 实验方法  55-56
    4.2.1 细菌的培养  55
    4.2.2 细菌的计数  55
    4.2.3 细菌对小鼠的急性毒性实验  55
    4.2.4 细菌在小鼠体内各器官的动态分布  55-56
    4.2.5 小鼠脾脏细胞中APC感染率的检测  56
  4.3 结果与分析  56-61
    4.3.1 细菌对小鼠急性毒性试验  56-57
    4.3.2 细菌在小鼠体内各器官的动态分布  57-59
    4.3.3 细菌对脾脏APC的侵袭力  59-61
  4.4 讨论  61-63
    4.4.1 细菌在小鼠体内各器官的分布  61-62
    4.4.2 细菌对脾脏APC的侵袭力  62-63
  4.5 小结  63-64
第5章 Ⅰ型菌毛对C57BL/6小鼠基因表达影响的研究  64-70
  5.1 实验材料  64-65
    5.1.1 菌种和细胞  64
    5.1.2 实验动物及相关试剂  64-65
    5.1.3 主要试剂及溶液的配制  65
  5.2 实验方法  65-66
    5.2.1 细菌与细胞的相互作用  65-66
    5.2.2 细胞 RNA提取  66
    5.2.3 小鼠基因芯片  66
  5.3 结果和分析  66-67
    5.3.1 细胞总RNA电泳  66
    5.3.2 小鼠细胞差异表达基因  66-67
  5.4 讨论  67-69
  5.5 小结  69-70
结论  70-71
参考文献  71-77
致谢  77-78
附录  78

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 细菌病 > 杆菌病
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