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黑林1号杨转几丁质酶基因的研究

作　者: 彭巍
导　师: 王志英；王占斌
学　校: 东北林业大学
专　业: 森林保护学
关键词: 黑林1号 几丁质酶基因 农杆菌介导 遗传转化
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 25次
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内容摘要


黑林1号（Populus simonii×Populus nigra）×Populus 15 ACL是以小黑杨为母本,波兰15A为父本,人工杂交选育的优良无性系,其根系发达,生长迅速,抗旱、耐寒。7年生材积生长量平均比小黑杨大42%。该品系可用于营造农田、防护林、用材林。本论文以MS+0.3mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA为分化培养基、WPM+0.4mg/L IBA为生根培养基,以外源几丁质酶基因为目的基因,在此基础上进行黑林1号的组培体系建立及遗传转化研究,通过叶片及组培苗茎段的敏感性试验,最终确定叶片分化时卡那霉素的临界浓度为20mg/L,芽诱导生根时卡那霉素的临界浓度为10mg/L,抑菌抗生素头孢塞肟钠500mg/L的浓度不会对黑林1号叶片分化及生根培养产生不利影响。成功摸索出农杆菌介导的黑林杨遗传转化体系:选取生长20d左右的幼嫩黑林杨组培苗叶片,通过主叶脉剪2～3下,预培养2～3d;将培养至对数生长期的农杆菌(OD600=0.5～0.7)离心后用液体MS培养基或无菌蒸馏水稀释成OD600=0.3～0.4浓度进行浸染;侵染时间为6～10min;共培养2～3d后,转入到筛选培养基中进行诱导不定芽的产生（含有20mg/L卡那霉素和500mg/L的头孢塞肟钠）,以及生根阶段的卡那霉素连续筛选（含有10mg/L卡那霉素和500mg/L的头孢塞肟钠）。通过农杆菌介导法将外源几丁质酶基因导入到黑林1号杨基因组中,为黑林1号的遗传转化及抗性育种提供了理论基础。PCR分子检测经过两次继代后成活的转化苗,有8株出现特异性扩增条带,而阴性对照没有特异性条带出现;通过PCR-Southern进一步分子杂交检测,出现了特异性的杂交条带,阳性率为100%,说明外源基因已经整合到黑林1号基因组中。黑林1号的遗传转化中最高转化率达到4.12%。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-7
1 绪论  7-15
  1.1 课题背景  7-8
  1.2 杨树抗真菌病基因转化现状  8-9
  1.3 几丁质酶基因及其应用  9-12
    1.3.1 几丁质酶特性  9-10
    1.3.2 几丁质酶的作用机理及可诱导性  10-11
    1.3.3 几丁质酶抗真菌病害的应用  11-12
  1.4 基因工程的遗传转化技术  12-15
    1.4.1 基因枪法  12-13
    1.4.2 PEG法  13
    1.4.3 花粉管通道法  13
    1.4.4 农杆菌介导法  13-15
2 材料与方法  15-30
  2.1 材料  15-18
    2.1.1 菌株与质粒  15
    2.1.2 植物材料与植物培养基  15
    2.1.3 植物激素  15
    2.1.4 抗生素  15-16
    2.1.5 培养细菌用LB培养基  16
    2.1.6 常用溶液配制  16
    2.1.7 酶及其他生化试剂  16-17
    2.1.8 PCR-Southern杂交试剂  17
    2.1.9 主要仪器设备  17-18
  2.2 试验方法  18-28
    2.2.1 主要技术路线  18
    2.2.2 黑林1号组培体系的建立  18-19
    2.2.3 不同浓度抗生素对分化、生根的影响  19-20
    2.2.4 农杆菌介导的抗病基因转化  20-22
    2.2.5 转基因植株的分子检测  22-28
    2.2.6 转化植株的获得与扩繁  28
  2.3 本章小结  28-30
3 结果与分析  30-42
  3.1 黑林1号组培体系的建立  30
    3.1.1 分化培养基筛选  30
    3.1.2 生根培养基筛选  30
  3.2 抗生素浓度与分化及生根的关系  30-33
    3.2.1 卡那霉素对叶片分化的影响  30-31
    3.2.2 卡那霉素对茎段生根及生长的影响  31-32
    3.2.3 头孢霉素对叶片分化的影响  32
    3.2.4 头孢霉素对茎段生根及生长的影响  32-33
    3.2.5 头孢霉素浓度与农杆菌生长的关系  33
  3.3 转化受体材料的选择  33
  3.4 农杆菌介导的遗传转化条件  33-37
    3.4.1 菌液浓度对叶片分化和转化的影响  33-34
    3.4.2 预培养时间与叶片分化和转化的关系  34-35
    3.4.3 侵染时间与叶片分化率和转化率的关系  35-36
    3.4.4 共培养对叶片分化和转化的影响  36
    3.4.5 筛选方法与叶片分化、转化的关系  36-37
  3.5 抗性植株的获得和芽的生根  37-38
  3.6 转基因植株的分子检测  38-40
    3.6.1 黑林1号基因组DNA的提取  38
    3.6.2 转化植株的PCR检测  38-39
    3.6.3 转基因植株PCR-Southern分子杂交检测  39-40
  3.7 本章小结  40-42
结论与建议  42-44
参考文献  44-49
附录A  49-50
附录B  50-51
附录C  51-52
攻读学位期间发表的学术论文  52-53
致谢  53-54

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶乔木 > 杨
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