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α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达

作　者: 李联正
导　师: 何维明；张惟材
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: α-乙酰乳酸脱羧酶枯草芽孢杆菌双乙酰克隆表达活性测定
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC，EC4．1．1．5）可以转化双乙酰的前体α-乙酰乳酸为乙偶姻而不影响啤酒风味。双乙酰是啤酒发酵代谢中的一种不良风味物质。由于降低双乙酰是啤酒成熟过程中最费时的步骤，所以加速该步骤对于啤酒酿造工业具有重要的意义。本研究包括枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的分离和在大肠杆菌中的表达；利用大肠杆菌稀有密码子的转移RNA提高α-乙酰乳酸脱羧酶表达水平及表达活性的尝试；α-乙酰乳酸脱羧酶在毕赤酵母中分泌表达；含有ALDC基因重组啤酒酵母的构建几个部分。 PCR扩增出枯草杆菌168α-乙酰乳酸脱羧酶基因，分别克隆到大肠杆菌质粒pUC18和pQE60中，构建了重组质粒pUC18-ALDC和pQE60-ALDC。序列测定结果表明编码α-乙酰乳酸脱羧酶的全长基因插入了载体pUC18；在T5启动子下，经IPTG诱导α-乙酰乳酸脱羧酶基因得到了表达，进行ALDC定性和定量测定，酶活力为0.11U／mL。为了促进α-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的表达，分别构建了pOK12-argU和pOK12-ileX两个重组质粒。pOK12-argU含有argU基因可以转录出精氨酸的转移RNA(tRNA^Arg)；pOK12-ileX含有ileX基因可以转录出异亮氨酸的转移RNA(tRNA^ileX)两个质粒分别和重组质粒pQE60-ALDC在大肠杆菌TOP10中共表达，通过活性测定和SDS-PAGE分析，结果表明表达水平得到提高。将ALDC基因克隆到了大肠—酵母穿梭质粒pPIC9中，得到的重组质粒电击转化导入巴斯德毕赤酵母GS115株中，α-乙酰乳酸脱羧酶基因基因整合到了毕赤酵母染色体上，得到可以稳定表达该基因的工程酵母菌株。在甲醇的诱导下，可以分泌表达出有α-乙酰乳酸脱羧酶活性的蛋白产物。SDS-PAGE分析可见到约62kDa的表达条带，活力测定为0.03U／mL。将α-乙酰乳酸脱羧酶基因克隆大肠—酵母穿梭质粒pYES2中，电击转化啤酒酵母实验菌株INVSc1，得到了可以降低双乙酰的工程菌株。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-8
第一章 α-乙酰乳酸脱羧酶研究进展  8-23
  1.1 啤酒发酵  8-9
  1.2 双乙酰的生成和还原  9-12
  1.3 α-乙酰乳酸脱羧酶基因的特点  12-14
  1.4 α-乙酰乳酸脱羧酶  14-17
  1.5 α-乙酰乳酸脱羧酶克隆表达  17-20
  1.6 啤酒酵母的改良  20-21
  1.7 本论文的研究工作  21-23
第二章 ALDC在大肠杆菌中的表达和活性测定  23-41
  2.1 材料  23-24
  2.2 方法  24-31
  2.3 结果和讨论  31-40
  2.4 讨论  40
  2.5 小结  40-41
第三章双质粒共表达α-乙酰乳酸脱羧酶  41-53
  3.1 材料和方法  41-46
  3.2 结果  46-52
  3.3 讨论  52
  3.4 小结  52-53
第四章在ALDC在毕赤酵母中的分泌表达  53-66
  4.1 材料与方法  53-57
  4.2 结果  57-64
  4.3 讨论  64-65
  4.4 小结  65-66
第五章含有目的基因啤酒酵母工程菌的构建  66-75
  5.1 材料  66-67
  5.2 方法  67-69
  5.3 结果  69-73
  5.4 讨论  73-74
  5.5 小结  74-75
总结  75-76
参考文献  76-80
致谢  80-81
英文缩写表  81-82
作者简介  82

α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达

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