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万古霉素高产菌株的选育研究

作　者: 江凌
导　师: 杜连祥
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 万古霉素东方拟无枝酸菌高效液相色谱法诱变育种链霉素抗性筛选
分类号: TQ465
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

本论文通过诱变育种得到万古霉素（Vancomycin）高产菌株东方拟无枝酸菌Amycolatopsis Orientalis-29,并对其发酵条件进行了优化,同时建立了万古霉素的检测方法。使用紫外线对东方拟无枝酸菌Amycolatopsis Orientalis进行诱变处理,利用链霉素抗性筛选法进行初筛,最终得到高产菌株AO-29。在此基础上,优化了高产菌株AO-29的培养工艺和发酵培养基,提高了万古霉素的产量。分别对高效液相色谱法和二剂量管碟法测定万古霉素的各项参数进行了研究,最终选择高效液相色谱法（HPLC）作为检测万古霉素产量的方法。采用RP-HPLC法,色谱柱选用Phenomenex prodigy 5 μ ODS3 100A(250×4.60mm,5μm柱,以三乙胺缓冲液（磷酸调节pH3.3）:乙腈:四氢呋喃=92:7:1为流动相,流速为1.5mL.min^-1,检测波长为216nm。在该色谱条件下,在80μg.mL^-1～600μg·mL^-1浓度范围内有良好的线性关系。利用琼脂块法对A.Orientalis-1进行纯化,选择了发酵性能较好的4号菌株作为出发菌株,摇瓶产量0.794g/L。以东方拟无枝酸菌A.Orientalis-4为出发菌株,经紫外线诱变处理,筛选链霉素抗性突变株,从中获得万古霉素高产变株AO-29,其发酵效价较出发菌株提高167%。传代实验表明该变株的高产性能遗传特性较稳定。通过对发酵培养基和各项参数的优化,确定最佳培养基方案和发酵条件:采用牛肉膏18g/L,棉籽饼粉12g/L,蔗糖26g/L,麦芽糖38g/L,磷酸二氢钾0.005%,硝酸钾0.6%,氯化镁0.03%,发酵培养基初始pH值7.1,接种龄48h,接种量7%,摇床转速170r/min,装液量为25mL,培养温度为28℃,在36h时添加0.2%酪氨酸。万古霉素的产量达到3.66g/L。

全文目录

1 前言  7-26
  1.1 万古霉素的发现  7
  1.2 万古霉素的性质  7-8
    1.2.1 万古霉素的结构特性  7-8
    1.2.2 万古霉素理化性质  8
  1.3 万古霉素的作用机制  8-9
  1.4 万古霉素类糖肽抗生素的构效关系  9
  1.5 万古霉素的应用  9-11
    1.5.1 适应症和用途  10
    1.5.2 临床药理  10-11
    1.5.3 微生物学  11
  1.6 万古霉素的检测  11-12
    1.6.1 生物检测方法  11
    1.6.2 高效液相色谱(HPLC)法  11-12
  1.7 万古霉素的菌种选育  12-16
    1.7.1 次级代谢产物菌种改良的策略和手段  12-14
    1.7.2 链霉菌的育种进展  14-16
  1.8 链霉素抗性基因筛选方法的研究  16-17
    1.8.1 链霉素的抗菌作用机制  16
    1.8.2 链霉素抗性和抗生素合成之间的关系  16-17
  1.9 万古霉素的研究概况  17-21
    1.9.1 万古霉素的结构研究  17
    1.9.2 万古霉素的生物合成途径  17-21
  1.10 万古霉素的发酵工艺研究进展  21-23
  1.11 万古霉素分离提取的研究  23-24
  1.12 万古霉素国内外市场发展动态  24-25
    1.12.1 国外市场成熟，销售平缓发展  24
    1.12.2 商业销售持续增长迅速  24-25
  1.13 本论文立项背景  25
  1.14 论文的主要研究内容  25-26
2 材料与方法  26-33
  2.1 实验材料  26-28
    2.1.1 菌种  26
    2.1.2 主要药品  26-27
    2.1.3 主要仪器  27
    2.1.4 相关溶液  27
    2.1.5 培养基  27-28
  2.2 方法  28-32
    2.2.1 分析方法  28-30
    2.2.2 生产菌生物量的测定—核酸量表示法  30
    2.2.3 pH值的测定  30
    2.2.4 诱变育种及筛选方法  30-31
    2.2.5 紫外线诱变方法的确定  31-32
    2.2.6 链霉素抗性突变株的筛选  32
  2.3 菌种性能的研究方法  32-33
    2.3.1 菌种活化  32
    2.3.2 孢子悬浮液的制备  32
    2.3.3 种子培养  32
    2.3.4 摇瓶发酵培养  32-33
3 结果与讨论  33-63
  3.1 万古霉素检测方法的确定  33-40
    3.1.1 高效液相色谱法检测万古霉素的产量  33-36
    3.1.2 二剂量管碟扩散法测定万古霉素基本参数的确定  36-39
    3.1.3 二剂量管碟法与HPLC法的相关性  39-40
  3.2 万古霉素生产菌株的诱变育种  40-44
    3.2.1 出发菌株的选择与纯化  40-41
      3.2.1.1 出发菌株的选择  40
      3.2.1.2 琼脂块法初筛纯化出发菌株  40-41
    3.2.2 抗链霉素高产万古霉素菌株的选育  41-44
  3.3 菌株AO-29培养基的优化  44-52
    3.3.1 碳源对AO-29菌株生长和万古霉素合成的影响  44-45
    3.3.2 氮源对AO-29菌株生长和万古霉素合成的影响  45-46
    3.3.3 发酵培养基碳氮源组成的优化试验  46-49
    3.3.4 无机盐对万古霉素合成的影响  49-52
  3.4 菌株AO-29培养参数的优化  52-57
    3.4.1 种龄对AO-29菌株发酵的影响  52-53
    3.4.2 接种量对AO-29菌株发酵的影响  53-54
    3.4.3 温度对发酵的影响  54-55
    3.4.4 溶氧对发酵的影响  55-56
    3.4.5 发酵培养基初始pH值对AO-29发酵的影响  56-57
  3.5 前体对万古霉素生物合成的影响  57-61
    3.5.1 乙酸盐对万古霉素生物合成的影响  57-59
    3.5.2 酪氨酸对万古霉素生物合成的影响  59-61
  3.6 菌株29号在发酵过程中的菌丝形态变化  61-62
  3.7 优化条件下的摇瓶分批发酵代谢曲线  62-63
4 结论  63-64
5 展望  64-65
参考文献  65-69
致谢  69-70
论文发表情况  70

万古霉素高产菌株的选育研究

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