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乳酸菌作为益生菌的差异基因AFLP筛选

作　者: 迟琼
导　师: 陶爱林
学　校: 广州医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 乳酸菌益生菌免疫调节扩增片段长度多态性分析基因克隆
分类号: R371
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 41次
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内容摘要

乳酸菌作为益生菌的重要代表,它的益生功能吸引人们越来越多的关注。长期食用乳酸活菌所引起的免疫耐受性却会造成机体受有害菌的侵染,找出乳酸活菌所含有的益生因子(Probiotic)成为解决此问题的一个重要途径。遵照此目的,本课题通过提取三种乳酸杆菌和一种乳球菌的基因组DNA,进行扩增片段长度多态性分析,筛选与对照组肠道条件致病菌之间在基因水平的差异,为进一步研究有调节免疫功能起到益生作用的蛋白质奠定基础。目的:利用生物信息学软件完成蛋白聚类分析,初步了解这些菌的蛋白组的分布概况,期望通过对不同菌同类蛋白的比较,可以发现不同菌之间的一些蛋白差异。通过对四种乳酸菌和四种肠道条件致病菌的扩增片段长度多态性分析,筛选差异益生菌与致病菌之间共同的基因差异。方法:1.蛋白聚类分析:在Uniprot数据库中已经进行了gene ontology分类,通过其ID就可以找到对应的gene ontology分类号。选择了四类可能与乳酸菌的益生功能相关蛋白,如下,分别是:cell adhesion,establishment of localization,protein secretion,signal transduction,用PROMALS进行序列Alignment,再以mega绘制蛋白树。2.扩增片段长度多态性分析:来自不同菌的基因组DNA经双酶切后及接头连接后,再经两次PCR,产物上PAGE胶检测,筛选益生菌与致病菌之间的共同差异条带。3.基因克隆:差异条带回收后测序,进而锁定相应全长基因,在相应的菌中克隆全长基因,构建蛋白表达载体在原核中进行蛋白表达。结果:1.依据同类蛋白对不同乳杆菌进行聚类分析,结果显示不同乳杆菌之间存在高度相似性;2. AFLP差异基因筛选方面,采用两组内切酶,共筛选了36对引物,初步确定9个差异片段,并进行了测序分析,搜索得到了相应的全长基因;3.在植物乳杆菌中克隆了2个全长候选基因(sugar transport protein)和(citrate lyase beta chain),并构建表达载体。结论:1. AFLP检测到的差异基因可能是乳酸菌起到益生作用的决定因素。2.基于一定的保守性的遗传背景和两类具有固定表型差异的群体,采用AFLP方法可以获得可靠的差异基因。

全文目录

中英文对照  5-6
中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
前言  10-15
  1. 研究背景  10-13
    1.1 乳酸菌的作用  10-11
    1.2 应用  11-12
    1.3 乳酸菌应用的缺陷  12-13
  2. 研究现状  13-14
  3. 研究设想  14-15
材料与方法  15-31
  1. 材料、试剂与仪器  15-18
    1.1 主要仪器  15-16
    1.2 实验材料  16-18
  2. 实验方法  18-31
    2.1 乳酸杆菌蛋白树分析  18
    2.2 乳酸杆菌体外培养  18-19
    2.3 乳球菌体外培养  19-20
    2.4 肠道条件致病菌的体外培养  20
    2.5.DNA 的提取  20-22
    2.6.AFLP 分析检测  22-24
    2.7 多态片段的回收再扩增以及克隆测序  24-26
    2.8 候选基因的克隆和表达载体构建  26-30
    2.9 Rosetta-pET-zhi6 菌株蛋白表达  30-31
结果  31-45
  1. 乳酸杆菌蛋白树分析结果  31-34
  2. 所用细菌基因组DNA 提取结果  34
  3. AFLP 分析  34-41
    3.1 预扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果  34-35
    3.2 选择性扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果  35-36
    3.3 变性PAGE 胶电泳银染结果  36-37
    3.4 差异性条带再扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果  37-38
    3.5 克隆测序及分析  38-41
  4. 目标基因的克隆及表达载体构建  41-45
    4.1 蛋白全长编码序列  41
    4.2 两个全长基因的克隆和表达载体构建  41-44
    4.3.zhi6-JDM1-0914 全长基因的编码蛋白表达  44-45
讨论  45-48
  1. 益生菌研究的重要性和热点  45
  2. 蛋白聚类分析的目的  45-46
  3. AFLP 分析及差异基因编码蛋白的表达和体外试验  46-48
结论  48-49
展望  49-50
附图  50-55
综述  55-61
参考文献  61-65
致谢  65-66
在攻读硕士学位期间论文发表情况  66-67

乳酸菌作为益生菌的差异基因AFLP筛选

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