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转CpTI基因苹果特异蛋白质分析和抗虫性株系的筛选

作　者: 王璐
导　师: 杜国强
学　校: 河北农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果豇豆胰蛋白酶抑制剂基因蛋白质棉蛉虫较正死亡率类胰凝乳蛋白酶
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本研究以转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(Cowpea Trypsin Inhibitor,CpTI)苹果(Mahts domestica Borkh)组培苗和相对敏感品系的棉蛉虫(Helicoverpa armigera)为试材,采用叶片蛋白质的等电聚焦电泳和毛细管区带电泳分析,研究了外源基因在植株体内蛋白质水平上的表达;同时以饲喂幼虫的方式,分析幼虫的较正死亡率和虫体内的类胰凝乳蛋白酶活力的变化,初步筛选出具有抗虫特性的苹果株系。转基因苹果品种为嘎拉、王林、乔纳金、富士,为经根癌农杆菌介导的叶圆片转化法转化高效启动子启动的CpTI基因转化株系。其中嘎拉品种选用46个株系,编号为1～46;王林9个株系编号为47～55;乔纳金3个株系编号为56～58;富士2个株系编号为59,60。主要实验结果如下: 1.较为优化的适宜苹果叶片蛋白质的等电聚焦电泳程序为:采用改良丙酮沉淀法提取苹果叶片蛋白质;电泳过程中聚丙烯酰胺凝胶浓度为3.66%,两性电解质范围为3.5～9.0,浓度为2%每管加样蛋白质量为33.8μg;电泳:恒压100V,10min;恒压500V,10min;恒压750V,3h 30min;电泳后考马斯亮蓝R-250染色,先固定再染色。 2.等电聚焦结果显示:嘎拉株系中2,8,11,12,14,19,27,31,32,33,34,36共12个株系在pH值6.18～6.30之间发现有一特异条带;王林品种4个株系的电泳结果与对照有差异,分别为47,50,51,55在pH值6.18～6.30之间有一特异条带;富士59在pH值6.18～6.30之间发现有一特异条带;乔纳金品种中没有发现有特异条带出现。 3.较为优化的适宜苹果叶片蛋白质的毛细管电泳程序:采用改良丙酮沉淀法提取蛋白质,电泳过程中温度为25℃,电压为20kV,0.5psi进样5s,电泳时间为17min,检测波长在280nm处的蛋白质区带。电泳结果表明:与对照相比嘎拉株系12,19,32,39在第7.65分钟分别出现一条特异峰带。 4.虫试结果显示部分转CpTI基因苹果株系有较强的杀虫和抑虫作用,株系最高虫试死亡率是100%,为株系32,51。其中较正死亡率为正值的株系共28个,分别为:2,4,8,9,10,11,12,13,16,17,19,21,24,27,31,32,33,34,36,39,43,47,50,51,55,56,58和59,其中株系2,12,27,31,32,34,39,50,51,56较正死亡率大于等于50%,表明这些株系有明显的杀虫和抑虫效果,并且经秩合检验分析,喂食27,31,32和51的虫重与对照虫重相比差异显著,表明株系27,31,32,51有明显抑制幼虫生长发育的作用。 5.喂食转CpTI基因苹果组培苗的棉蛉虫体内类胰凝乳蛋白酶活性变化的测定实验表明:部分转基因株系有明显的抑制虫体内类胰凝乳蛋白酶活性的作用,但部分株系抑制能力较弱甚至没有抑制能力。以转基因苗株系喂食棉虫幼虫,共9个株系使

全文目录

1 引言  11-17
  1.1 转抗虫基因植物研究现状  11-13
    1.1.1 蛋白酶抑制剂基因及其应用  11-12
    1.1.2 苏云金芽孢杆菌及其应用  12-13
  1.2 外源基因在转基因植物中的表达  13
    1.2.1 转化外源基因的瞬时表达  13
    1.2.2 转化外源基因的稳定表达  13
  1.3 蛋白质电泳技术及其在园艺植物蛋白质分析上的应用  13-15
    1.3.1 等电聚焦电泳  13-14
    1.3.2 毛细管电泳  14-15
  1.4 抗虫性株系的筛选  15-16
    1.4.1 CpTI基因的抗虫机理  15
    1.4.2 抗性植株的室内鉴定  15-16
    1.4.3 虫体内类胰凝乳蛋白酶活力的测定  16
  1.5 本研究课题的目标  16-17
2 材料与方法  17-24
  2.1 试验材料  17
    2.1.1 供试材料  17
    2.1.2 药品与试剂，仪器  17
  2.2 试验方法  17-24
    2.2.1 转CpTI基因苹果组培苗的培养  17-18
    2.2.2 棉蛉虫的饲养  18
    2.2.3 蛋白质电泳样品提取方案  18-19
    2.2.4 蛋白质含量的测定方法  19-20
    2.2.5 蛋白质等电聚集电泳胶条的制备  20
    2.2.6 等电聚焦电泳程序的筛选方案  20
    2.2.7 等电聚焦电泳染色程序的筛选方案  20-21
    2.2.8 pH值的测定方法  21
    2.2.9 毛细管电泳体系  21-22
    2.2.10 转化株系抗虫性检测  22
    2.2.11 类胰凝乳蛋白酶活性的测定方法  22-24
3 结果与分析  24-35
  3.1 等电聚焦电泳技术优化与转基因株系特异蛋白识别  24-27
    3.1.1 蛋白质提取方法对蛋白质的量和电泳结果的影响  24-25
    3.1.2 AP与TEMED用量对聚合时间和胶条质量的影响  25
    3.1.3 上样蛋白量对蛋白质条数和分辨率的影响  25
    3.1.4 电极缓冲液种类对聚焦结果的影响  25-26
    3.1.5 电压与电泳时间对聚焦结果的影响  26
    3.1.6 不同考马斯亮蓝染色程序对染色灵敏度的影响  26
    3.1.7 等电聚焦电泳鉴定转CpTI基因组培苗中特异蛋白质  26-27
  3.2 毛细管区带电泳体系优化与特异蛋白峰的鉴定  27-28
    3.2.1 检测波长对毛细管电泳结果的影响  27
    3.2.2 毛细管电泳鉴定CpTI特异蛋白  27-28
  3.3 抗虫性株系的鉴定  28-35
    3.3.1 转化株系抗虫性检测结果  28-31
    3.3.2 类胰凝乳蛋白酶活力变化检验植株抗性  31-35
4 讨论  35-41
  4.1 等电聚焦电泳程序的优化  35-37
    4.1.1 关于样品处理方法问题  35
    4.1.2 丙烯酰胺的聚合  35
    4.1.3 关于电极溶液的选择  35-36
    4.1.4 关于等电聚焦的时间及电泳程序  36
    4.1.5 关于等电聚焦的染色程序  36
    4.1.6 载体两性电解质的选择  36
    4.1.7 等电聚焦的聚焦效应  36-37
  4.2 毛细管电泳的分离效应  37
  4.3 转CPTI基因苹果植株抗性的鉴定  37-38
    4.3.1 抗虫实验鉴定转CpTI基因苹果抗性  37
    4.3.2 蛋向酶活性的变化评价转基因株系抗虫能力  37-38
  4.4 外源基因不表达的可能机制与原因  38
  4.5 结果的相关性  38-39
  4.6 转抗虫基因植物前景展望  39-41
5 结论  41-42
参考文献  42-47
附录：图版  47-49
在读期间发表的学术论文  49-50
作者简介  50-51
致谢  51

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