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猪乙型脑炎病毒检测方法的建立

作　者: 崔奕杰
导　师: 杨润德
学　校: 河北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪乙型脑炎病毒引物设计反转录-聚合酶链式反应 SPA协同凝集试验
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本研究建立了诊断猪乙型脑炎病毒的试验方法—反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）。从GenBank中查出收录的31株猪乙型脑炎病毒E基因的已知序列,用DNASTAR软件对这31株猪乙型脑炎病毒E基因进行同源性分析,以确定扩增的靶序列。以这段靶区域为模板,利用Primer5软件设计合成了一对引物,建立了反转录-聚合酶链式反应检测乙脑病毒的方法。扩增出的RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可见362bp的特异性条带。将扩增产物酶切,电泳结果显示扩增产物被切成两条特异性条带。用建立的RT-PCR技术进行特异性试验,对4株河北地区乙型脑炎病毒分离株进行检测,结果该引物对4株乙脑病毒均能扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物。对猪伪狂犬病病毒闽A株（PRV）;猪细小病毒（PPV7909）;猪瘟病毒石门强毒株（HCV）;猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及正常鼠脑对照进行扩增;结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该法可检出稀释至256倍的鼠脑毒,相当于14个TCID₅₀。以上结果表明该法与其他检测JEV抗原的方法相比,具有高度的特异性和灵敏性,可从分子水平上对JEV进行快速诊断。为使鉴别诊断方法易于在临床上推广,大众化,易操作,直观,本研究还建立了SPA协同凝集试验来诊断乙脑。用富含A蛋白的金黄色葡萄球菌国际标准株（Cowan Ⅰ）标记了抗乙脑病毒的高免血清,建立了诊断猪乙型脑炎的SPA平板协同凝集试验。经特异性试验,敏感性试验,对比性试验,保存期测定及临床检测表明,该方法具有敏感性高,特异性强,重复性好等优点,且操作方法简便,快速,节省材料,无需特殊仪器,适用于基层猪场对流行性乙型脑炎的快速诊断和流行病学调查。本研究还摸索了一种从SDS-聚丙烯酰胺凝胶中回收纯化乙型脑炎病毒单一蛋白抗原成分的方法。将鸡胚毒进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以确定要回收蛋白的分子量,电洗脱回收目的蛋白,将回收的蛋白免疫豚鼠,琼扩检测豚鼠血清效价,SPA协同凝集试验检测豚鼠血清为阳性,试验结果表明,用这种方法纯化的抗原能够诱导出良好的抗体反应,为制备特异性抗体奠定了基础。

全文目录

1 引言  9-15
  1.1 简史  9
  1.2 乙脑危害  9-10
  1.3 乙脑流行特征  10
  1.4 乙脑病毒的病原学特性  10-11
  1.5 乙脑的致病机制  11
  1.6 乙脑病毒的分子生物学特性  11-13
  1.7 乙脑的诊断  13
  1.8 乙脑的防治  13-15
2 材料和方法  15-26
  2.1 毒株与细胞  15
  2.2 实验动物  15
  2.3 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)所需主要试剂  15
  2.4 SPA协同凝集所需主要试剂  15-16
    2.4.1 菌种  15
    2.4.2 培养基  15-16
    2.4.3 0.01M pH7.4 PBS缓冲液  16
  2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，免疫电泳及水平电泳所需主要试剂  16-17
    2.5.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂  16
    2.5.2 水平电泳所需试剂  16
    2.5.3 免疫电泳所需主要试剂  16-17
  2.6 主要仪器  17
  2.7 病毒的增殖及抗血清的制备  17-18
    2.7.1 JEV SA14-14-2毒株接种鸡胚  17
    2.7.2 JEV SA14-14-2毒株脑内接种乳鼠  17
    2.7.3 兔抗鸡胚毒血清制备  17-18
  2.8 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)  18-20
    2.8.1 引物设计与合成  18
    2.8.2 病毒增殖  18
    2.8.3 核酸提取  18-19
    2.8.4 RT-PCR扩增  19
    2.8.5 RT-PCR产物酶切分析  19
    2.8.6 RT-PCR特异性实验  19-20
    2.8.7 RT-PCR敏感性测定  20
    2.8.8 临床检测  20
  2.9 SPA协同凝集试验  20-22
    2.9.1 SPA菌稳定液的制备  20
    2.9.2 SPA菌诊断液的制备(即将上述稳定液与已知的抗血清结合)  20
    2.9.3 鼠脑毒的组织培养半数致死量(TCID_(50))测定及中和试验  20-21
    2.9.4 鼠脑毒检出浓度及兔抗鸡胚毒抗血清最佳标记浓度的确定  21-22
    2.9.5 JEV SPA诊断液的特异性试验  22
    2.9.6 对比免疫电泳实验  22
    2.9.7 SPA诊断液的保存期测定  22
    2.9.8 检测部位的确定  22
  2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳同收纯化JEV蛋白抗原成分  22-26
    2.10.1 JEV鸡胚毒的增殖  22-23
    2.10.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配制  23
    2.10.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定回收蛋白的分子量  23-24
    2.10.4 从SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电洗脱目的回收蛋白  24
    2.10.5 回收的蛋白免疫豚鼠  24-25
    2.10.6 琼脂扩散试验检测豚鼠抗血清效价  25
    2.10.7 SPA-协同凝集试验检测豚鼠抗血清阳性  25-26
3 结果与分析  26-35
  3.1 病毒的增殖及抗血清的制备  26-27
    3.1.1 鸡胚毒的增殖  26
    3.1.2 鼠脑毒的增殖  26
    3.1.3 兔抗鸡胚毒免疫血清的制备结果  26-27
  3.2 反转录-聚合酶链式反应结果  27-29
    3.2.1 RT-PCR扩增结果  27
    3.2.2 RT-PCR扩增产物酶切分析结果  27-28
    3.2.3 RT-PCR特异性结果  28
    3.2.4 RT-PCR敏感性结果  28-29
    3.2.5 临床检测结果  29
  3.3 SPA协同凝集试验结果  29-33
    3.3.1 鼠脑毒TCID_(50)测定及中和试验结果  29-30
    3.3.2 鼠脑毒检出浓度的确定  30-31
    3.3.3 兔抗鸡胚毒血清最佳标记浓度的确定  31
    3.3.4 JEV SPA诊断液的特异性试验结果  31
    3.3.5 免疫电泳实验结果  31-32
    3.3.6 SPA诊断液的保存期测定  32
    3.3.7 检测部位的确定  32-33
  3.4 从聚丙烯酰胺凝胶中回收纯化乙脑病毒蛋白抗原成分  33-35
    3.4.1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对回收蛋白分子量的确定  33
    3.4.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确证回收效果  33-34
    3.4.3 豚鼠抗血清效价测定  34
    3.4.4 SPA协同凝集试验检测豚鼠血清阳性  34-35
4 讨论  35-38
  4.1 乙脑病毒检测的难点  35
  4.2 RT-PCR技术是一种快速敏感特异的检测乙脑病毒的方法  35
  4.3 Trizol法提取乙脑病毒的核酸  35-36
  4.4 抽提RNA病毒核酸时应注意的问题  36
  4.5 葡萄球菌A蛋白的特点  36
  4.6 影响SPA协同凝集试验的因素  36-37
  4.7 SPA协同凝集试验适用于临床快速检测  37
  4.8 从聚丙烯酰胺凝胶中回收纯化乙型脑炎病毒蛋白抗原成分  37-38
5 结论  38-39
参考文献  39-42
在读期间发表的学术论文  42-43
作者简历  43-44
致谢  44

猪乙型脑炎病毒检测方法的建立

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