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脂多糖对肺动脉内皮细胞I型Na～+/H～+交换器表达和活性的影响及机制研究

作　者: 赵澎涛
导　师: 李志超
学　校: 中国人民解放军第四军医大学
专　业: 病理生理学
关键词: 急性肺损伤脂多糖内皮细胞 Ⅰ型Na~+/H~+交换器钙离子乳酸脱氢酶拉西地平细胞内酸化 pH值细胞凋亡细胞增殖反转录聚合酶链式反应激光共聚焦显微镜
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

在感染、创伤、术后等致病因素中，急性肺损伤(acute lung injury,ALI)为常见的并发症和致死原因，ALI是指由心源性以外的各种肺内外治病因素导致的急性进行性缺氧性呼吸功能障碍，其严重阶段称为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，迄今仍无满意的治疗措施，病死率高达50％以上。革兰氏阴性杆菌所产生的内毒素(endotoxin)是导致ALI的最重要的致病因素，脂多糖(LPS)是内毒素的有效致病成份。ALI病程中，肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞广泛受损，肺血管完整性、反应性、通透性发生明显改变，进而导致一系列病理改变，其中，LPS对肺动脉内皮细胞(pulmonary artery endothelial cell,PAEC)的影响发生的最早，也最明显。LPS对PAEC的影响主要表现为损伤作用，导致内皮细胞肿胀，坏死，脱落。因而，深入研究LPS对PAEC的损伤机制，对于防止PAEC的损伤，保护肺血管壁的完整性，进而防治ALI的发生具有重要意义。 NHE是新近发现的广泛存在于细胞膜上的一种离子交换蛋白，介导1:1的细胞外钠离子和细胞内氢离子交换。目前已经发现NHE有7种亚型，其中NHE1分布最为广泛，几乎在所有组织细胞中均有一定水平的表达，NHE1所起到的作用不同于其他亚型，即NHE1属于管家基因，主要参与：a．细胞 pHi的调节：b．控制胞内的渗透压及细胞体积；c．影响细胞的增殖、分化和死亡，在血管内皮系统表达的即为NHE1。在LPS对血管内皮细胞的损伤过程中，NHE1是否起到关键性的作用，国内外尚未见到相关报道，这一问题引起了我们的兴趣。本研究拟在细胞水平上探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的ALI模型中，NHE1的基因表达及功能变化及其与内皮细胞死亡的关系。研究内容：1)以离体培养的牛PAEC为研究对象，提取总RNA，应用反转录PCR、DNA电泳等技术观察LPS对体外培养的牛PAEC中NHE1基因表达的影响；2)MTT比色法检测细胞的存活率，按常规比色法测定上清中LDH活力：3)激光共聚焦镜检测LPS引起的细胞内游离钙离子浓度改变；4)应用第四军医大学硕士学位论文 BECEF－AM荧光探针染色，观察LPS引起的细胞内pH值变化，通过细胞酸化后细胞内pH值的恢复速率检测各条件下细胞膜上NHEI功能的改变。本研究的主要结果如下： l）LPS对培养的BPAECs存活率的影响 LPS作用 48小时后，各组 MTT比色实验的光密度值分别为 0．35士0．07‘，0．31 土0刀7‘，0．13土0刀4‘，明显低于对照组0．44士0刀6（‘P＜o．01，n一！0），表明uS引起SPAEC死亡增加。 2）LPS对培养的BPAECs上清液中LDH活性的影响加入低浓度 LPS（0．01 g．mla）后，各时间点 4h． sh． 16h、24h上清液中 LDH 活性术有明显改变：加入中浓度（o．1卜g．M‘）后，各时间点LDH活性分别为 212土23、256士36、322士56、406土85，加入高浓度（1．on g．ml－）LPS后各时间点LDH活性分别为343士115、497士142、571士89、560上129，均明显高于对照组18．1土11．2、25．4士10．3、94．6士37．2、105．6土60．7（P（ 001，n＝6），表明LPS对BPAECS有明显的损伤作用。 3）LPS对培养的BPAECS中NHE－l的基因表达的影响 RT－PCR结果显示，3个实验组e／c（NHE－1和p－actin电泳条带光密度值之比）为0．43士0．厂人83士0．N，1．22土0．19，显著高于对煦组0工8士0．0以P＜0．川，n＝4）； 4个时间点e／c分别为0．36士0．5，0．42士0．10，050土0刀7，0石4士0．13，也显著高于对照组0．28士0．08（P＜0．of，n＝4）。这表明在LPS（0．of一l．opg．ml”’）作用－－F内皮细胞NHEI表达增加。 4）DMA对LPS引起的细胞损伤的影响使用抑制齐D＊A抑制＊HB的活性后，LpS（Ol阳．m／）作用24卜，M TTTT 比色OD值为0．43士0刀2，高于LPS组0．38士0刀2（P＜0．of，n＝＝8）；LDH活性为238．86士58．23低于LPS组403厂6士引．54（P＜0．of，n二8），表明DMA能够减轻LPS对内皮细胞的损伤。 4 第四军医大学项士学位论文 5）LPS对培养的BPAECS内 CJ”的影响用浓度分别为O．01pg．M10．lpg．M1，1＊pg．m＊的＊＊与SPA ＊Q共培养8 小时后，FIU。－3标记，激光共聚焦镜检测细胞内荧光光密度值分别为 28石9士 1．97、 53．86士2．38、6o．12士2．09，明显高于对照组ZO．76士2．54（P＜O．m，n二8），表明在 ins作用下 sn＾sc内的时”增多。 6）拉西地平对细胞损伤的影响同时力入 LacidiPine（10‘n mol二 ml‘）和 LPS（．l卜g．ml”‘），作用 24h后，上清中uH活力为317 U几，明显低于rS的单独作用（423U几）（P＜O．01，n＝＝8）， ?

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-11
英文摘要  11-14
前言  14-16
文献回顾  16-27
实验一脂多糖对肺动脉内皮细胞Ⅰ型Na~+／H~+交换器表达的影响  27-46
  材料和方法  27-33
  结果  33-42
  讨论  42-46
实验二脂多糖对肺动脉内皮细胞Ⅰ型Na~+/H~+交换器活性的影响  46-64
  材料和方法  47-50
  结果  50-58
  讨论  58-64
小结  64-66
致谢  66-67
参考文献  67-83
学习期间发表的论文  83

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