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磁性纳米材料体内靶向基因治疗胃癌的实验研究

作　者: 陈刚
导　师: 刘海峰
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 胃癌 NHE1 基因氧化铁纳米颗粒多聚赖氨酸反义基因治疗磁靶向治疗
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

目的:传统的基因治疗方法大都缺乏靶向性,严重地阻碍了基因治疗研究的快速发展,开发新的基因载体是增强基因治疗靶向性的关键问题。纳米技术的发展,为解决基因转移载体问题提供了新的思路。体积微小、具有超顺磁性的氧化铁磁性纳米颗粒,有望成为理想的基因载体材料。胞膜离子交换蛋白Na+-H+交换泵1(NHE1)是维持细胞内pH 值在中性或偏碱性的重要膜蛋白,与胃癌的发生发展有密切关系,可能是基因治疗胃癌的一个理想靶点。本研究拟构建同时具有生物功能、磁性靶向功能和基因治疗功能的NHE1 反义基因磁性纳米微粒,体外转染胃癌细胞,观察基因转染对胃癌细胞生物学行为的影响,然后通过观察NHE1 反义基因磁性纳米微粒在裸鼠体内的靶向作用及对裸鼠胃癌移植瘤生长的抑制作用,探讨磁性纳米材料体内靶向基因治疗胃癌的可行性。为胃癌的基因治疗研究一种体内基因转移的新型纳米材料载体,为胃癌的基因治疗和靶向治疗探索一条新的途径。方法:应用共沉淀法制备外包葡聚糖的氧化铁磁性纳米颗粒(DCIONP)。使用透射电镜和激光粒度检测仪检测DCIONP 的形态和粒径,采用琼脂糖凝胶电泳分析氧化铁磁性纳米颗粒结合NHE1 反义基因及抵抗DNase I 消化的能力,采用磁场吸引的方法分析氧化铁磁性纳米颗粒携带NHE1 反义基因定向运动的能力。以DCIONP 作为转染载体,将携有增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的pEGFP-N3 质粒转入SGC-7901 胃癌细胞中,确定最佳转染条件。以DCIONP 作为转染载体将NHE1 反义基因表达质粒转入SGC-7901 胃癌细胞中,经聚合酶链反应(PCR)对转染基因的整合鉴定后,观察基因转染对细胞内NHE1 蛋白表达、细胞增殖、凋亡的影响。建立裸鼠胃癌移植瘤模型后,进行体内靶向定位实验,通过检测肿瘤组织中的铁元素含量,观察NHE1 反义基因磁性纳米微粒在肿瘤组织内的聚集情况。将NHE1 反义基因磁性纳米颗粒注入裸鼠尾静脉,肿瘤区外加磁场引导,观察抑瘤率。结果:(1)透射电镜观察显示:纳米颗粒形状不规则,颗粒内部有一氧化铁的核心。激光粒度检测仪检测证实DCIONP 的平均粒径在47nm 左右,粒径分布较窄。(2)结合实验的琼脂糖凝胶电泳显示,pll-DCIONP 在各种质量比均有良好的DNA 结合能力。(3)DNA 保护实验显示,从质量比0.5:1 开始pll-DCIONP 能有效保护DNA 不被DNaseI降解。(4)沉淀实验证明,pll-DCIONP 可携带质粒DNA 在外加磁场作用下在液体中定向移动。(5)体外转染实验显示,pll-DCIONP 与质粒DNA 质量比为5:1 时转染胃癌细胞的转染效率最高,达22.86%。(6)免疫组化染色显示, Anti-7901 细胞染色比SGC-7901 细胞、Zeo-7901 细胞浅淡,着色少,表明NHE1 蛋白表达明显减少。(7)流式细胞仪分析显示,Anti-7901 细胞凋亡率为11.75%,显著高于Zeo-7901 细胞凋亡率4.40%和SGC-7901 细胞凋亡率3.85%。Anti-7901 细胞增殖指数与Zeo-7901 和SGC-7901 细胞相比,轻度降低。(8)实验组肿瘤组织铁含量(μg/g)为79.38±8.64,显著高于对照组(38.13±9.37,p<0.01﹚,表明在磁场作用下NHE1 反义基因磁性纳米微粒定向移动,大量聚集在肿瘤组织内。(9)NHE1 反义基因磁性纳米微粒+磁场组抑瘤率为33.8%,高于NHE1 反义基因磁性纳米微粒组(0.8%),NHE1 反义基因磁性纳米微粒+磁场组裸鼠瘤重(g)为1.78±0.80,小于生理盐水组(2.65±0.62)和NHE1 反义基因磁性纳米微粒组(2.63±0.71),但没有统计学差异,表明体内靶向基因治疗对裸鼠胃癌移植瘤的生长产生了一定的抑制作用。结论:(1)本实验成功制备了平均粒径为47nm 的外包葡聚糖氧化铁纳米颗粒。(2)成功构建了NHE1 反义基因磁性纳米微粒,证明了经多聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒可以结合NHE1 反义基因并保护其不受核酸酶的降解,而且可携带NHE1 反义基因在外加磁场作用下在液体中定向移动,最后聚集在磁场强度高的区域。(3)利用经多聚赖氨酸修饰的氧化铁纳米颗粒为基因载体,完成了NHE1 反义基因对SGC-7901 胃癌细胞株的转染。(4)转染NHE1 反义基因后, SGC-7901 胃癌细胞生长速度明显减慢,出现接触抑制,呈单层生长,增殖指数降低,细胞凋亡增加。提示NHE1 反义基因对SGC-7901 胃癌细胞的恶性行为有明显抑制作用。(5)在磁场作用下NHE1 反义基因磁性纳米微粒定向移动,大量聚集在肿瘤组织内,成功实现了NHE1 反义基因磁性纳米微粒在裸鼠体内针对肿瘤的磁靶向定位。(6)在磁场引导下,NHE1 反义基因磁性纳米微粒对裸鼠胃癌移植瘤产生了一定的抑制作用。(7)氧化铁磁性纳米颗粒这种制作简单、成本低廉的物质,有望成为一种理想的基因转染载体,用于体内靶向基因治疗。本研究初步证明了磁性纳米材料体内靶向基因治疗胃癌的可行性,为肿瘤治疗提出了一个新的探索方向。

全文目录

英文缩写一览表  4-6
英文摘要  6-9
中文摘要  9-11
论文正文磁性纳米材料体内靶向基因治疗胃癌的实验研究  11-50
  前言  11-12
  材料与方法  12-19
  结果  19-23
  讨论  23-31
  结论  31-32
  致谢  32-33
  图片  33-45
  参考文献  45-50
文献综述医用纳米控释系统在肿瘤治疗中的应用  50-56
  参考文献  53-56
攻读硕士期间撰写论文及参编专著  56

磁性纳米材料体内靶向基因治疗胃癌的实验研究

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