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山羊羔肠道淋巴集结提取物的分离、效应检测及特异表达基因的获得

作　者: 陈小鹏
导　师: 张燕君
学　校: 山东大学
专　业: 发育生物学
关键词: 肠道淋巴集结免疫增强剂免疫活性差减文库羊白鲳
分类号: S963.736
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

水产养殖业在我国国民经济发展中占有重要地位,在病害防治方面,通常使用大量抗菌素,造成环境污染并易产生抗药性,对人类健康造成危害。用生物免疫活性因子作为饲料添加剂来提高水产养殖生物抗病害能力,不破坏养殖区水体的生态,不损害养殖生物的生理机能,材料廉价易得,生产成本低。本研究取出生15(±2)日的山羊羔,分离其肠道淋巴集结(peyer’s patch,PP),包括回肠淋巴集结(Ileum peyer’s patch, IPP)和空肠淋巴集结(Jejunumpeyer’s patch, JPP),经反复冻融,离心收集得到PP粗提物,作为饲料添加剂,检测了其对淡水白鲳多项免疫指标的影响。通过对白鲳白细胞吞噬活性、血清抗菌活力、血清溶菌酶及血清溶血素活性的测定结果发现,添加PP粗提物的实验组白鲳,各项免疫指标较只喂基础饲料的对照组显著提高,其中实验组白细胞吞噬活性达到52.33%,而对照组仅为20.67%,实验组与对照组相比增长达153%;实验组血清抗菌活力达0.675,而对照组仅为0.331,实验组与对照组相比增长达104%;溶菌酶活性基本呈同样变化规律,实验组达到0.15,而对照组平均在0.12,实验组与对照组相比增加了25%。这些结果表明PP粗提物可提高白鲳非特异性免疫功能。在添加PP粗提物后,实验组血清溶血素达到8.67,而对照组平均在4.33,实验组相对于对照组增加了100%,表明PP粗提物可提高白鲳特异性免疫功能。PP粗提物对白鲳血清酚氧化酶(phenoloxidase, PO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性提高的效果不明显。从PP粗提物对鱼体生长影响的实验结果看,添加PP粗提物饲喂15天后,白鲳总体重增长率为23.69%,而对照组的总体重增长率仅为10.98%,实验组比对照组多增重11.3%;对照组饵料系数为6.43,实验组为2.99,实验组相对于对照组饵料系数降低了53.5%,表明PP粗提物呵促进白鲳生长。这可能是由于PP提取物提高了鱼体的免疫力,使健康状况改善,或粗提物有促生长因子而表现出促进生长的综合效果。为进一步确认PP粗提物中的活性组分,本实验采用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-25凝胶层析的方法对其进行了初步的分离纯化,共得18种组分。以小鼠脾淋巴细胞体外细胞培养作为特异免疫反应的模型,分别将18种PP组分

全文目录

目录  3-6
符号说明  6-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
综述鱼类免疫增强剂研究进展  12-28
  一、鱼类免疫系统及免疫增强剂的作用机理  12-13
  二、免疫增强剂在水产养殖中的应用  13-22
  参考文献  22-28
第一部分山羊羔肠道淋巴集结提取物的分离纯化及效应检测  28-58
  材料与方法  29-38
    一、材料  29-33
    二、肠道淋巴集结粗提物的制备  33
    三、PP粗提物对鱼体免疫功能的影响  33-36
      1、实验动物的饲养和处理  33-34
      2、PP粗提物对白鲳白细胞吞噬活性的影响  34
      3、PP粗提物对白鲳血清抗菌活力的影响  34-35
      4、PP粗提物对白鲳血清溶菌酶活性的影响  35
      5、PP粗提物对白鲳血清溶血素的影响  35
      6、PP粗提物对白鲳血清酚氧化酶活力的影响  35-36
      7、PP粗提物对白鲳血清超氧化物歧化酶活力的影响  36
      8、PP粗提物对白鲳生长的影响  36
    四、PP粗提物的分离纯化  36-37
    五、PP各组分促进小鼠脾淋巴细胞增殖的效应检测  37-38
    六、实验数据的统计学处理  38
  实验结果  38-51
    一、PP粗提物对白鲳白细胞吞噬活性的影响  38-39
    二、PP粗提物对白鲳血清抗菌活力的影响  39
    三、PP粗提物对自鲳血清溶菌活性的影响  39-40
    四、PP粗提物对白鲳血清溶血素的影响  40-41
    五、PP粗提物对白鲳血清酚氧化酶活力的影响  41
    六、PP粗提物对白鲳血清超氧化物歧化酶活力的影响  41-42
    七、PP粗提物对白鲳生长的影响  42-43
    八、山羊羔肠道淋巴集结粗提物的分离纯化  43-46
    九、PP各组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响  46-51
      1、PP各组分促进小鼠脾淋巴细胞增殖的直接效应的检测  46-48
      2、PP各组分协同Con A促进小鼠脾淋巴细胞增殖的效应检测  48-49
      3、PP各组分协同LPS促进小鼠脾淋巴细胞增殖的效应检测  49-51
  讨论  51-55
    一、PP粗提物对鱼体免疫功能的影响  51-54
    二、PP各组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响  54-55
  参考文献  55-58
第二部分山羊羔肠道淋巴集结特异表达基因差减文库的构建  58-88
  材料与方法  58-75
    一、材料  58-59
    二、方法  59-75
      1、山羊羔肠道淋巴集结和非淋巴集结肠壁组织总RNA的提取  59-60
      2、山羊羔肠道淋巴集结差减cDNA文库的构建  60-73
      3、cDNA文库重组质粒提取  73-74
      4、cDNA文库重组质粒测序  74-75
  实验结果  75-83
    一、RNA的提取  75
    二、SMART PCR cDNA合成  75-77
    三、cDNA的酶切、纯化和加接头  77-78
    四、差减杂交  78
    五、差减cDNA片段的克隆、文库质粒的提取和酶切检测  78-79
    六、差减文库的测序  79-82
    七、B细胞刺激因子的序列和同源性分析  82-83
  讨论  83-86
  参考文献  86-88
工作总结和下一步工作计划  88-89
已发表与待发表论文  89-90
致谢  90

山羊羔肠道淋巴集结提取物的分离、效应检测及特异表达基因的获得

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