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稻瘟病菌成熟附着胞cDNA文库的构建及转几丁质酶基因毛壳菌的抗病原真菌作用的研究

作　者: 卢建平
导　师: 李德葆
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌毛壳菌附着胞 cDNA文库 cDNA差减文库 SHH 几丁质酶生防作用
分类号: S435.111
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

稻瘟病菌[Magnaporthe grisea]附着胞是稻瘟病菌在侵入水稻组织前形成的一种侵染结构,是稻瘟病菌侵染过程中的一个关键环节。了解稻瘟病菌附着胞阶段基因表达的状况对于弄清附着胞形成、发育和侵入机制具有重要的意义。本论文第一部分研究了形成24小时的稻瘟病菌附着胞基因表达及与菌丝、孢子基因表达的差异,为寻找参与稻瘟病菌附着胞形成、发育过程或穿透过程的关键基因打下了基础。球毛壳菌[Chaetomium globosum]和绿色木霉[Trichoderma viride]都是重要的生防真菌,几丁质酶和葡聚糖酶等分泌性酶类被认为在木霉等真菌的生防过程起重要作用,而关于毛壳菌生防过程中细胞壁降解酶的作用还缺少研究。本论文第二部分试图利用从绿色木霉基因组DNA中克隆到的内切几丁质酶基因(chbi),转入球毛壳菌CG12菌株中,研究其表达状况,探讨几丁质酶在提高毛壳菌生防中的可能作用。主要研究结果如下: 1、本论文借助SMART技术和长距离PCR技术构建了水稻稻瘟病菌成熟附着胞(发育24小时)的cDNAλ噬菌体文库。cDNA文库的滴度为2.37×10~6,插入片段平均大小为660bp。随机挑选的12个克隆经测序,获得9条平均长度为470bp的EST序列,contig组装为8条非冗余EST序列。这8条EST在NCBI上用blastn进行相似性联配,发现有2条EST序列在GenBank中没有登记过。本cDNA文库基本反映了24小时阶段稻瘟病菌附着胞的基因表达状态,适合用于研究稻瘟病菌附着胞阶段基因的功能分析。 2、本论文利用SSH技术构建了稻瘟病菌发育24小时附着胞与稻瘟病菌菌丝/孢子cDNA之间的差减文库(附着胞cDNA差减文库)。重组质粒经测序获得250条EST序列。这些EST经contig组装后,得到155条非冗余EST序列。155条非冗余EST序列在Magnaporthe grisea Database用blast进行相似性联配,并逐个比较分析EST序列对应的基因组DNA序列,确定这155条EST

全文目录

第一章文献综述  14-33
  1 稻瘟病菌  14
  2 稻瘟病菌病侵染循环  14-15
  3 稻瘟病菌附着胞形成过程  15-17
  4 参与稻瘟病菌附着胞形成过程的基因  17-28
    4.1 黑色素基因  17-18
    4.2 孢子形成基因  18-19
    4.3 参与植物表面识别和信号传导过程的基因  19-26
    4.4 其它附着胞相关基因  26-28
  5 稻瘟病菌致病相关基因的研究方法  28-32
  6 本研究的目的和内容  32-33
第二章稻瘟病菌附着胞cDNA文库的构建  33-54
  1 材料和方法  33-46
    1.1 试验菌株、产孢培养和附着胞诱导  33
    1.2 试剂和培养基  33-34
    1.3 RNA提取和分析  34-36
    1.4 长距离PCR法合成cDNA  36-40
    1.5 cDNA文库构建  40-44
    1.6 质粒pTriplEx2的插入片段的验证  44-45
    1.7 部分重组pTriplEx2质粒的测序和EST序列分析  45
    1.8 稻瘟病菌附着胞EST序列的登录  45-46
  2 结果和分析  46-50
    2.1 稻瘟病菌附着胞的诱导培养  46
    2.2 附着胞总RNA的提取  46-47
    2.3 cDNA的合成  47
    2.4 cDNA文库的构建和质量分析  47-49
    2.5 部分cDNA克隆的测序结果及其分析  49-50
  3 讨论  50-52
    3.1 稻瘟病菌附着胞诱导效率  50-51
    3.2 附着胞RNA的提取和cDNA的合成策略  51
    3.3 附着胞cDNA文库的质量和EST序列的分析  51-52
  4 本章小结  52-54
第三章稻瘟病菌附着胞SSH差减文库的构建  54-87
  1 材料和方法  54-63
    1.1 试验菌株、产孢培养和附着胞诱导  54
    1.2 试剂和培养基  54
    1.3 RNA提取和分析  54-55
    1.4 长距离PCR法合成cDNA  55
    1.5 Alu I限制性内切酶消化  55-56
    1.6 接头连接  56-57
    1.7 第一次差减杂交  57-58
    1.8 第二次差减杂交  58-59
    1.9 PCR扩增  59-60
    1.10 PCR反应液与pBS-T载体的连接  60
    1.11 E Coli DH5α感受态细胞的制备  60-61
    1.12 感受态细胞的转化  61
    1.13 X-gal和IPTG直接用于琼脂平板  61-62
    1.14 CTAB法抽提质粒  62
    1.15 重组质粒的测序和EST序列分析  62
    1.16 稻瘟病菌附着胞差减文库EST序列的登录  62
    1.17 SSH差减文库克隆的RT-PCR分析  62-63
  2 结果和分析  63-72
    2.1 附着胞和菌丝、孢子的RNA提取  63-64
    2.2 附着胞和菌丝、孢子ds cDNA合成  64-65
    2.3 差减杂交cDNA的第一次PCR扩增结果  65
    2.4 差减杂交cDNA的第二次PCR扩增结果  65
    2.5 PCR产物与pBS-T载体的连接、转化和重组质粒提取  65
    2.6 测序结果分析  65-70
    2.7 RT-PCR验证SSH差减基因在附着胞中的表达特异性  70-72
    2.8 43KD的DNA片段  72
  3 讨论  72-78
    3.1 SSH文库的构建  72-73
    3.2 SSH cDNA文库分析  73-74
    3.3 过氧化物酶体基因与乙醛酸循环  74-75
    3.4 与附着胞形成和致病性有关的基因  75-76
    3.5 与其它文库结果的比较  76
    3.6 附着胞特异表达基因簇  76-78
  4 本章小结  78-79
  5 附录  79-87
    5.1 附录1：RT-PCR引物  79-86
    5.2 附录2：CM固体(液体)培养基配方  86-87
第四章转几丁质酶基因毛壳菌的抗病原真菌作用  87-100
  1 材料和方法  87-93
    1.1 质粒和菌株  87-88
    1.2 球毛壳菌原生质体的制备  88-89
    1.3 球毛壳菌原生质体的转化  89
    1.4 CTAB法提取真菌基因组DNA  89-90
    1.5 转chbi的CG12菌株的PCR验证  90-91
    1.6 转chbi基因的CG12菌株的几丁质酶活性测定  91-92
    1.7 拮抗试验  92-93
  2 结果  93-97
    2.1 毛壳菌原生质体的提取和转化  93
    2.2 PCR验证结果  93-94
    2.3 毛壳菌CG12转化子的几丁质酶活性  94
    2.4 拮抗试验结果  94-97
  3 讨论  97-99
  4 本章小结  99-100
  5 附录  100
参考文献  100-112

稻瘟病菌成熟附着胞cDNA文库的构建及转几丁质酶基因毛壳菌的抗病原真菌作用的研究

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