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工业酿酒酵母菌株met10基因敲除及其用于工业生产可行性的研究

作　者: 刘波
导　师: 金建玲
学　校: 山东大学
专　业: 遗传学
关键词: 酿酒酵母 抗氧化 亚硫酸盐还原酶 基因敲除 啤酒
分类号: TS261.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


啤酒的维生素群以及矿物质含量丰富,并被列为营养食品,如果适量饮用,啤酒绝对是对健康有益的低度酒精饮料。啤酒中所含各种成分既有较高的营养价值又具有良好的药疗效果,对于一些疾病有一定的预防及治疗作用。 然而啤酒的老化是啤酒行业面临的严重问题,它直接关系到啤酒的销售及企业的效益,如何解决啤酒的氧化问题已成为国内外研究的重点。目前预防啤酒老化有多种措施,其中最理想的措施之一就是构建具有能增加啤酒中亚硫酸盐含量的酿酒酵母菌株。 亚硫酸盐是食品及啤酒行业普遍采用的抗氧化剂,在啤酒酿造过程中能与醛类物质发生加成反应而起稳定风味的作用。然而在啤酒酿造过程中形成的亚硫酸盐被亚硫酸盐还原酶还原而不能在啤酒中积累,故其在发酵液中含量一般较低,不能起到稳定啤酒风味的作用。酿酒酵母met10基因编码亚硫酸盐还原酶的α亚基。该基因部分或全部缺失会使亚硫酸盐还原酶失活,发酵液中亚硫酸盐不被还原而得以积累,这样既能增强啤酒的抗氧化能力,又能增加啤酒风味的稳定性,同时也可以解决传统发酵终了外加亚硫酸盐而导致啤酒产生H2S的问题。 本研究采用LFH-PCR法从质粒pFA6a-kanMX4及酿酒酵母染色体上构建了两端带有酿酒酵母met10基因同源序列的具有G418抗性的外源基因片段。利用完整细胞转化法将构建的外源基因片段导入工业酿酒酵母细胞内,外源基因片段通过同源重组而整合于酿酒酵母染色体,破坏酿酒酵母met10基因从而得到met10基因敲除菌株。 通过1吨发酵罐发酵试验,比较了met10基因敲除菌株和原始酿酒酵母工业菌株的生长性状、发酵性能及啤酒中乙醛、酯、高级醇及亚硫酸盐等成份的含量,发现met10基因敲除菌株较原始菌株生长快、发酵度高、发酵周期短:啤酒中游离亚硫酸盐含量并未明显提高但啤酒中乙醛等醛类物质含量有较大程度的降低,从而提高了啤酒风味的稳定性:met10基因敲除菌株对于发酵液中的双乙酰还原能力较原始菌株差。通过100吨啤酒发酵罐发酵啤酒及贮存试验表明,met10基因敲除菌株酿造的啤酒比外加亚硫酸盐的啤酒口感更好,贮存时间也较长。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-10
第一章 绪论  10-24
  1．1 啤酒及啤酒的功能性  10-11
  1．2 啤酒风味老化及预防措施  11-12
  1．3 啤酒中亚硫酸盐保持啤酒稳定的作用机制及其来源  12
  1．4 酿酒酵母的亚硫酸盐代谢途径  12-13
  1．5 酿酒酵母的选育及改良  13-16
    1．5．1 酿酒酵母的研究动态  13-14
    1．5．2 酿酒酵母的选育  14-16
  1．6 标记基因的应用及剔除  16-21
    1．6．1 标记基因的利用  16
    1．6．2 标记基因对受体细胞影响及安全问题  16-17
    1．6．3 标记基因的剔除  17-21
  1．7 酿酒酵母的遗传转化系统  21-22
    1．7．1 酿酒酵母的筛选标记  21
    1．7．2 酿酒酵母转化方法  21-22
  1．8 基因敲除  22-23
    1．8．1 基因打靶  22
    1．8．2 基因敲除  22-23
  1．9 本论文研究的目的及意义  23-24
第二章 酿酒酵母高效转化体系的建立  24-33
  2．1 材料与方法  24-30
    2．1．1 实验中所使用质粒及菌株  24
    2．1．2 试剂与设备  24-25
    2．1．3 溶液配置  25-26
    2．1．4 培养基  26-27
    2．1．5 CaCl_2法转化大肠杆菌DH5α  27
    2．1．6 质粒的提取  27-28
    2．1．7 DH5α转化子的筛选  28
    2．1．8 琼脂糖凝胶电泳  28
    2．1．9 胶纯化 DNA  28
    2．1．10 酿酒酵母 H158感受态的制备  28-29
    2．1．11 PEG/ LiAc/ssDNA转化感受态酿酒酵母  29
    2．1．12 酵母质粒的提取  29-30
  2．2 结果与讨论  30-32
    2．2．1 CaCl_2法转化大肠杆菌DH5α  30
    2．2．2 DH5α转化子质粒的提取  30
    2．2．3 酿酒酵母转化子验证  30
    2．2．4 PEG/LiAc/ssDNA转化效率的探索  30-32
      2．2．4．1 热激时间的影响  30-31
      2．2．4．2 单链鱼精 DNA的影响  31
      2．2．4．3 DMSO的影响  31-32
  2．3 本章小结  32-33
第三章 外源基因的构建及转化子的筛选  33-48
  3．1 材料与方法  34-40
    3．1．1 质粒及菌株  34
    3．1．2 试剂及培养基  34-35
    3．1．3 工业酿酒酵母 G418抗性验证  35
    3．1．4 PCR反应系统  35-36
    3．1．5 SFH-PCR法构建外源基因片段及酿酒酵母转化子验证  36-39
      3．1．5．1 引物设计  36
      3．1．5．2 第一轮 PCR扩增  36
      3．1．5．3 第二轮 PCR扩增  36
      3．1．5．4 胶纯化 DNA  36
      3．1．5．5 PCR产物直接转化工业酿酒酵母  36-37
      3．1．5．6 酵母转化子的筛选  37
      3．1．5．7 酵母染色体提取  37-38
      3．1．5．8 转化子验证  38
      3．1．5．9 酿酒酵母生孢  38
      3．1．5．10 同源序列比对  38-39
    3．1．6 LFH-PCR法构建外源基因片段及酿酒酵母转化子验证  39-40
      3．1．6．1 引物设计  39
      3．1．6．2 酵母染色体同源序列的克隆(第一轮 PCR)  39
      3．1．6．3 G418抗性基因的克隆(第二轮 PCR)  39-40
      3．1．6．4 增产物纯化、酵母转化及转化子验证  40
      3．1．6．5 转化子稳定性验证  40
  3．2 结果与讨论  40-46
    3．2．1 工业酿酒酵母的 G418抗性验证  40
    3．2．2 SFH-PCR法构建外源基因片段及酿酒酵母转化子验证  40-42
      3．2．2．1 第一轮 PCR扩增  40-41
      3．2．2．2 第二轮 PCR扩增  41-42
    3．2．3 转化子验证  42
    3．2．4 酵母生孢试验及序列比对结果  42
    3．2．5 转化子稳定性验证  42-43
    3．2．6 LFH-PCR法构建外源基因片段及酿酒酵母转化子验证  43-45
      3．2．6．1 met10同源序列的克隆结果  43-44
      3．2．6．2 G418抗性基因的克隆  44-45
    3．2．7 LFH-PCR产物的纯化及转化  45
    3．2．8 酿酒酵母转化子筛选及验证  45
    3．2．9 转化子稳定性验证  45-46
    3．2．10 基因序列测序  46
  3．3 本章小结  46-48
第四章 基因敲除菌株生长及发酵性状测定  48-61
  4．1 实验室摇瓶试验  48-52
    4．1．1 材料与方法  48-49
      4．1．1．1 试剂与培养基  48-49
      4．1．1．2 亚硫酸盐含量测定的标准曲线的制作  49
      4．1．1．3 发酵液中亚硫酸盐含量测定  49
      4．1．1．4 酵母产 H_2S能力的测定  49
    4．1．2 结果与讨论  49-52
      4．1．2．1 met10基因敲除菌株与原始菌株在的生长性能测定  49-51
      4．1．2．2 麦汁发酵中亚硫酸盐含量的测定  51-52
      4．1．2．3 敲除菌株与原始菌株产 H_2S能力的测定  52
  4．2 1000L发酵罐发酵试验  52-59
    4．2．1 材料与方法  52-54
      4．2．1．1 试剂与仪器  52
      4．2．1．2 酵母扩大培养  52-53
      4．2．1．3 发酵工艺  53
      4．2．1．4 发酵过程发酵液中亚硫酸盐含量测定  53
      4．2．1．5 发酵液中醛、酯及高级醇等物质的检测  53-54
    4．2．2 结果与讨论  54-59
      4．2．2．1 原始菌株与敲除菌株扩培及发酵特性  54-55
      4．2．2．2 发酵液中亚硫酸盐含量测定  55-56
      4．2．2．3 两株菌株发酵性能的比较  56
      4．2．2．4 气相色谱仪分析啤酒中醛、酯及高级醇含量  56-58
      4．2．2．5 两种发酵液口感的鉴定  58-59
  4．3 100吨啤酒发酵罐储存试验及啤酒风味稳定的研究  59-60
    4．3．1 啤酒的瓶装  59
    4．3．2 瓶装啤酒口感品尝  59
    4．3．3 瓶装啤酒风味物质检测  59-60
  4．4 本章小结  60-61
第五章 酿酒酵母染色体上 G418抗性基因的剔除  61-62
全文总结  62-63
参考文献  63-68
致谢  68-69

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 酿造工业 > 酿酒工业 > 酿酒微生物 > 酵母（各种曲）
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