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黄鳝促性腺激素释放激素的cDNA克隆与序列分析

作　者: 方平
导　师: 李英文
学　校: 西南农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 黄鳝 促性腺激素释放激素(GnRH) RACE 基因克隆
分类号: S917
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 240次
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内容摘要


促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)是下丘脑-垂体-性腺(hypothalamus-pituitary-gonadal, HPG)轴重要的信号分子,它是一种十肽,控制着垂体促性腺激素的合成和分泌,并对性别决定和分化有调控作用,在脊椎动物的性腺发育和繁殖功能的维持方面起着重要的调控作用。黄鳝(Monopterus albus)是我国常见的经济鱼类,因其具有特殊的性逆转现象,常用于水产动物性别决定及其性逆转机制的研究。黄鳝性逆转的发生机理目前还不清楚,但已有一些研究推测GnRH可能在黄鳝性逆转过程中发挥重要的作用。在黄鳝性腺发育和性逆转的研究中,关于GnRH的分子机理研究还没有文献报道。研究黄鳝GnRH基因可以填补黄鳝GnRH研究的欠缺,有助于进一步研究黄鳝性逆转发生的分子机制和下丘脑-垂体-性腺轴的协调作用机制,还可以为通过遗传工程创造有效的黄鳝繁殖技术提供基础。本研究克隆了黄鳝cGnRH-Ⅱ基因,并对其核苷酸序列及推导氨基酸序列以及预测的蛋白质高级结构进行了分析,主要研究结果如下: 1 黄鳝cGnRH-Ⅱ基因的全长cDNA序列 在对多种鲈型目鱼类的cGnRH-Ⅱ基因进行了多重比对后设计了2个特异性3’RACE引物,以来自黄鳝脑的mRNA为模板扩增得到了黄鳝cGnRH-Ⅱ的3’端序列。根据得到的3’端序列末端设计了两个5’RACE特异性引物,从而得到了黄鳝cGnRH-Ⅱ的5’端序列。分别从得到的3’端序列和5’端序列设计特异性引物扩增黄鳝cGnRH-Ⅱ全长cDNA。黄鳝cGnRH-Ⅱ全长cDNA为617bp,5’UTR长为168bp,编码区包括249个核苷酸,编码一个长83个氨基酸残基的蛋白质前体,3’UTR长为197bp。 2 黄鳝cGnRH-Ⅱ基因推导氨基酸序列的分析 通过克隆得到的3’端序列和5’端序列结果表明,黄鳝cGnRH-Ⅱ的cDNA全长617bp,包括一个5’非编码区、一个编码83个氨基酸的开放阅读框、TGA终止密码子和一个包括加尾信号和poly(A)尾巴的3’非编码区。编码区核苷酸长度为249bp,编码83个氨基酸,由信号肽(21个氨基酸)、cGnRH-Ⅱ(10个氨基酸)、三肽加工位点和联接肽(49个氨基酸)组成。其基因基本结构和从其他脊椎动物中克隆的GnRH成员的基因结构一致。 3 黄鳝cGnRH-Ⅱ基因的同源性分析

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
缩写词  10-11
第1章 文献综述  11-23
  1.1 黄鳝的研究概况  11-17
    1.1.1 黄鳝的生物学研究  11-12
    1.1.2 黄鳝的繁殖发育研究  12-13
    1.1.3 黄鳝的内分泌研究  13-14
    1.1.4 黄鳝的性逆转研究  14-15
    1.1.5 黄鳝分子生物学方面的研究  15-17
  1.2 GNRH的研究概况  17-20
    1.2.1 GnRH的分子结构的变异型  17-19
    1.2.2 GnRH基因  19
    1.2.3 GnRH在脊椎动物中的分布和进化  19-20
  1.3 鱼类GnRH的研究现状及展望  20-23
第2章 引言  23-25
第3章 材料与方法  25-35
  3.1 动物材料、载体和菌种  25
    3.1.1 动物材料  25
    3.1.2 菌种及质粒  25
  3.2 试剂和试剂盒  25-26
    3.2.1 主要分子生物学试剂  25
    3.2.2 试剂盒  25
    3.2.3 溶液的配制  25-26
  3.3 主要仪器  26
  3.4 总RNA的提取  26
  3.5 引物设计  26-27
  3.6 RACE原理和程序  27-32
    3.6.1 GeneRacer Kit的RACE原理  27-28
    3.6.2 RNA的去磷酸化  28-29
    3.6.3 去除mRNA的帽子结构  29
    3.6.4 寡核苷酸与去帽mRNA的连结  29-30
    3.6.5 mRNA的反转录  30
    3.6.6 cDNA的放大扩增  30-31
    3.6.7 扩增cGnRH-Ⅱ基因cDNA 3'末端  31
    3.6.8 扩增cGnRH-Ⅱ基因cDNA 5'末端  31
    3.6.9 扩增cDNA序列的PCR反应体系和反应程序  31-32
  3.7 目的片段的克隆与测序  32-35
    3.7.1 凝胶电泳  32
    3.7.2 目的片段的回收  32
    3.7.3 大肠杆菌DH5α感受态的制备  32-33
    3.7.4 目的片段与pMD18-T载体的连接  33
    3.7.5 质粒DNA转化大肠杆菌  33
    3.7.6 转化子的蓝白菌落筛选  33
    3.7.7 转化子的菌液PCR扩增鉴定  33-34
    3.7.8 测序与生物信息学分析  34-35
第4章 结果与分析  35-45
  4.1 黄鳝脑总RNA的提取  35
  4.2 cDNA的获得  35
  4.3 cGnRH-Ⅱ基因的克隆  35-37
    4.3.1 cGnRH-Ⅱ cDNA 3'末端的扩增与克隆  35-36
    4.3.2 cGnRH-Ⅱ cDNA 5'末端的扩增与克隆  36-37
    4.3.3 cGnRH-Ⅱ基因全长cDNA的克隆  37
  4.4 cGnRH-Ⅱ基因的cDNA序列分析  37-39
  4.5 cGnRH-Ⅱ推导蛋白的分析  39-45
    4.5.1 cGnRH-Ⅱ推导蛋白的基本参数  39
    4.5.2 cGnRH-Ⅱ推导氨基酸序列同源性分析  39-43
    4.5.3 cGnRH-Ⅱ推导的氨基酸的系统分析  43
    4.5.4 cGnRH-Ⅱ蛋白的结构域预测  43-44
    4.5.5 cGnRH-Ⅱ蛋白二级结构预测  44-45
第5章 讨论  45-48
  5.1 关于总RNA的提取  45
  5.2 引物设计  45-46
  5.3 利用RACE法克隆基因的分析  46-47
  5.4 cGnRH-Ⅱ cDNA及推导氨基酸的分析  47-48
第6章 结论  48-49
参考文献  49-56
致谢  56-57
发表论文及参与课题情况  57

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学
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