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油茶丙酮酸激酶基因的全长cDNA及部分基因组序列克隆

作　者: 罗茜
导　师: 谢禄山；谭晓风
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 森林培育学
关键词: 油茶脂肪酸合成丙酮酸激酶基因 cDNA克隆 RACE 交错延伸PCR
分类号: S794.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

油茶是我国南方重要的木本油料树种,是世界四大木本油料树种之一。在油茶种子生长过程中,丙酮酸激酶(PK)基因作为糖酵解的关键酶,它控制生成的丙酮酸是脂肪酸合成的重要碳源,在光合产物转化为脂肪酸的过程中起重要作用。因此研究油茶的PK基因在揭示糖酵解对油脂合成的影响和油茶的分子育种具有重要意义。本论文主要研究结果如下：1、油茶PK基因的全长cDNA克隆。在经济林育种与栽培国家林业局重点实验室己构建的油茶cDNA文库中,鉴定出一条PK基因片断,长度为约900bp,并且含有一个polyA尾巴。将此cDNA序列同其它物种的同类序列进行比对发现相似性较高,并且此序列缺失5’端部分氨基酸残基及非编码区的cDNA序列。根据已知的PK基因EST序列,用专业软件Primer Premier 5.0设计了油茶PK基因的特异引物GSP1、GSP2和GSP3。以油茶‘湘林]号’品种种子为材料提取RNA,采用5’RACE技术,扩增出一条约1500bp的cDNA片断。将该片断克隆到pMD18-T载体上,并转化到大肠杆菌DH5α菌株中。经过菌液PCR检测、测序,得到该片断的cDNA序列。通过Vector NTI 9.0等生物信息学软件的分析,将该序列与原来的EST序列进行拼接,获得了一条长为2114bp的序列。根据拼接得到的序列,设计了两对引物OEF1、OER1和OEF2、OER2,其中OEF1位于PK基因序列的5’端,OER2位于3’端,OER1与OEF2位于5’RACE片断和EST片断的重迭区,且相向重迭13bp。采用交错延伸PCR技术,用OEF1、OER1扩增5’RACE片断,OEF2、OER2扩增EST片断,分别得到T1和T2,且它们有13bp的重迭部分。根据碱基互补原则,利用它们的重迭部分拼接成一个新的片断,之后加入OEF,和OER2来扩增拼接片断,从而获得了油茶PK基因的全长cDNA。2、部分基因组序列克隆。以油茶‘湘林1号’品种叶片提取的基因组DNA为材料,以交错延伸引物OEF2和OER2为引物,获得长2308bp的油茶PK基因部分基因组序列,通过NCBI网上比对确定其为油茶PK基因部分基因组序列。将油茶PK基因部分基因组序列与全长cDNA比较,分析预测此序列含两个外显子长度分别为476bp和220bp,一个内含子长度为1578bp。3、油茶PK基因的生物信息学分析。通过生物信息学软件Vector NTI 9.0对测序结果进行分析：PK基因cDNA序列长2114bp,含有一个1737bp的ORF,编码579个氨基酸残基；此外还含有长108bp的5端非编码区,长269bp的3端非编码区及一个长44bp的polyA尾巴。经过在GenBank上的序列比对获知此序列与其它物种的PK基因的相似性很高,由此确认此序列是油茶的PK基因的全长cDNA序列。根据PK基因的cDNA序列推导的蛋白质序列,应用一系列生物信息学软件对理化性质、高级结构、三维模型等进行预测分析,结果显示此蛋白的等电点pI为5.105,分子量为63766.5Da,稳定系数为52.95,属于不稳定蛋白质；有两个跨膜结构域,没有信号肽剪接位点,是一个非分泌蛋白；丝氨酸的磷酸化位点有37个,苏氨酸的磷酸化位点有5个,酪氨酸的磷酸化位点有2个；蛋白内含有32.30%的α-螺旋,20.90%的β折叠。模体搜索结果表明在PK上具有多种N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、丙酮酸激酶活性位点等多个功能结构域。同源建模的模型中我们可以发现12个明显α-螺旋。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 绪言  10-22
  1.1 油茶概述  10-11
    1.1.1 油茶cDNA文库和EST文库的构建  10-11
  1.2 丙酮酸激酶  11-17
    1.2.1 丙酮酸激酶的结构  11-12
    1.2.2 丙酮酸激酶活性及同工酶  12-13
    1.2.3 丙酮酸激酶的代谢调控  13-14
    1.2.4 丙酮酸激酶基因  14-15
    1.2.5 丙酮酸激酶的作用  15-17
  1.3 植物种子油及脂肪酸生物合成途径  17-18
  1.4 本研究的目的意义、主要内容和技术路线  18-22
2 油茶PK基因的全长cDNA及部分基因组序列克隆  22-50
  2.1 材料  22-24
    2.1.1 植物材料  22
    2.1.2 菌株与质粒  22-23
    2.1.3 主要试剂  23
    2.1.4 主要仪器设备及用品  23-24
  2.2 实验方法  24-42
    2.2.1 从油茶cDNA文库分离鉴定PK基因  24-25
    2.2.2 油茶PK基因的全长cDNA克隆  25-38
    2.2.3 油茶PK基因部分基因组DNA克隆  38-42
  2.3 结果与分析  42-46
    2.3.1 文库中PK基因重组子PCR检测电泳结果  42
    2.3.2 油茶种子总RNA的提取质量  42-43
    2.3.3 5'RACE的电泳结果  43-44
    2.3.4 PCR检测5'RACE的克隆片断  44
    2.3.5 T_1、T_2及油茶PK基因全长cDNA的电泳检测  44
    2.3.6 油茶叶片DNA的提取质量  44-45
    2.3.7 DNA-PCR扩增的电泳检测  45-46
    2.3.8 重组子检测  46
  2.4 讨论  46-50
    2.4.1 文库中分离鉴定PK基因  46
    2.4.2 油茶种子总RNA的提取  46
    2.4.3 RACE合成  46-47
    2.4.4 引物设计  47
    2.4.5 PCR扩增  47-48
    2.4.6 交错延伸PCR  48
    2.4.7 油茶总DNA提取  48-50
3 生物信息学分析  50-68
  3.1 材料与方法  50
    3.1.1 材料  50
    3.1.2 方法  50
  3.2 结果与分析  50-65
    3.2.1 油茶EST文库中3545号基因测序结果及序列分析  50
    3.2.2 5'RACE克隆片断的测序结果及序列分析  50-52
    3.2.3 油茶PK基因全长cDNA核苷酸序列分析  52-53
    3.2.4 油茶PK基因蛋白质序列分析  53-64
    3.2.5 油茶PK基因部分基因组序列分析  64-65
  3.3 讨论  65-68
4 结论与创新  68-70
  4.1 结论  68
  4.2 创新点  68-70
参考文献  70-76
附录A:实验药品  76-78
附录B:英文缩略词及中英文对照  78-79
攻读学位期间的主要学术成果  79-80
致谢  80

油茶丙酮酸激酶基因的全长cDNA及部分基因组序列克隆

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