|
脑血管病是目前世界上最常见的老年疾病之一,发病率、致残率及复发率均高,与心脏病、恶性肿瘤构成人类的三大致死病因,其中缺血性脑血管病占全部脑血管病的大部分,是最常见的脑卒中。慢性脑供血不足最早是在1990年由日本医学家提出来的,是指各种原因导致大脑出现慢性的广泛的供血不足,引发脑部缺血缺氧而出现一系列脑部功能障碍临床表现的疾病。目前脑血管病后大脑功能的可塑性研究成为了医疗界的热点。影响脑血管病后功能恢复的因素十分复杂,大致可分为促进因素和抑制因素两个方面。脑缺血后能导致神经元损伤或死亡,但同时内部的神经保护机制也被激活,二者的平衡决定了缺血神经细胞的结局。胰岛素样生长因子(IGF-1)被公认为对脑缺血具有潜在的神经保护作用,在大鼠和羊的脑缺血模型上已得到证实。它是一种小分子多肽(7.5Kda),结构上类似胰岛素原,属于生长因子家族,对成熟神经元增殖、分化、存活具有重要的作用。而已有研究发现IGF-1可提高神经元的存活率,可促进神经突触形成,具有维持神经细胞功能、改善老龄动物的学习记忆能力的作用。在利用具有自发性卒中倾向的高血压大鼠制作脑缺血再灌注模型中,外源性注射IGF-1可使大鼠海马神经元调亡细胞减少,对损伤后神经元具有神经保护作用。成年哺乳动物中枢神经系统中存在能够限制神经损伤后神经再生功能的蛋白,髓鞘相关蛋白神经突起生长抑制分子Nogo是其中最主要的蛋白,分为Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C三种主要异构体,其中以Nogo-A与神经再生的关系最为密切,是哺乳动物中枢神经损伤后神经再生障碍的重要原因之一。Nogo-A作用的消除可以导致大脑缺血损伤部位结构的重塑和功能的恢复。同样Nogo-A基因的失活可以对卒中后的老鼠产生强烈的保护作用。有研究表明慢性脑缺血后认知能力的减退,是由于Nogo-A的强烈表达造成的,它能够使神经元间的纤维联系受损,抑制新生颗粒细胞的轴突生长,抑制慢性脑缺血后神经功能和认知能力的恢复。丁基苯酞(dl-butylphthalide,NBP)是我国自主研发的拥有自主知识产权的化学药物,具有安全性单一体结构,是治疗急性脑缺血的一种新药,在慢性脑缺血中研究较少。本文利用2VO建立慢性脑缺血模型,通过Morris水迷宫评价大鼠行为学变化,用免疫组化方法观察大鼠在对慢性脑缺血适应过程中的Nogo-A和IGF-1表达变化,并探讨丁基苯酞对其表达的影响和对大鼠实验性慢性脑缺血的保护作用。材料方法1.动物分组及给药方法健康Wistar大鼠80只,随机分为A组:对照组(假手术+溶剂);B组:单纯缺血组手术+溶剂);C组:缺血低剂量治疗组(手术+低剂量NBP+溶剂);D组:缺血高剂量治疗组(手术+高剂量NBP+溶剂);后两组于造模2月水迷宫结束后开始治疗,分别按60mg/kg、120mg/kg给予丁基苯酞灌胃,丁基苯酞用花生油稀释至2ml。前两组每日给予花生油2ml灌胃,各组皆连续每日灌胃,持续一个月。2.模型的制作钝性分离B、C、D组大鼠双侧颈总动脉,用O号手术线分别结扎其近心端及远心端;分离对照组双侧颈总动脉但不结扎。术后各组大鼠均在常规条件下饲养。3.标本的制作术后3月,所有大鼠经心脏灌注后,断头取脑,用4%的多聚甲醛固定后做石蜡切片,供HE染色和免疫组化用。4.观察指标4.1各组于2VO后3月行Morris水迷宫试验进行学习记忆能力的评价。4.2采用HE染色观察大鼠海马和颞叶皮层的神经元细胞变化。4.3免疫组化观察大鼠海马和颞叶皮层IGF-1和Nogo-A的表达。5.统计方法所有数据均采用均数士标准差(?)±s表示,应用SPSS10.0统计软件进行数据处理,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),用LSD法进行两两比较,取a=0.05作为显著性检验标准。结果1.实验动物行为观察术后各组大鼠均出现进食进水减少,精神差,行为异常。术后1-2天,除A组精神恢复外,其余各组行为恢复不明显。4-6天B、C、D大鼠逐渐恢复,一周时基本正常。2.认知能力利用Morris水迷宫测定后发现,2VO后3月B组与A组比较逃避潜伏期时间明显延长,跨过平台所次数明显减少,差异均具有统计学意义(P＜0.05):C、D组与B组比较逃避潜伏期时间明显减少,跨过平台次数明显增加,差异均具有统计学意义(P＜0.05),D组与C组比较避潜伏期时间减少,跨过平台次数有所增加,差异具有统计学意义(P＜0.05)3.HE染色A组:海马神经元细胞未见变性、坏死,细胞形态正常。B组:海马大量神经元细胞缺血性变性、坏死,正常神经细胞数较A组明显减少。C组:海马神经元变性、坏死较B组减轻,正常神经细胞数较B组明显增多。D组:海马神经元变性、坏死较C组明显减轻,正常神经细胞数较C组明显增多。4.IGF-1免疫组化染色各组取颞叶皮层和海马进行观察,并统计IGF-1蛋白表达的阳性细胞数,IGF-1阳性细胞在皮质区、海马区及纹状体区具有广泛性表达,阳性神经元胞浆呈棕黄色着色。A组IGF-1蛋白呈少量表达,B组IGF-1的表达与A组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。C组和D组IGF-1表达明显多于B组,差异有统计学意义(P＜0.05),且D组IGF-1表达明显多于C组,差异有统计学意义(P＜0.05)。5.Nogo-A免疫组化染色各组取颞叶皮层和海马进行观察,并统计Nogo-A蛋白表达的阳性细胞数,Nogo-A蛋白主要分布于大鼠脑内的小突胶质细胞及部分神经元和纤维胞浆及突起内,呈棕黄色或棕褐色着色。A组Nogo-A呈少量表达,B组Nogo-A表达均明显多于A组,差异有统计学意义(P＜0.05),C组和D组Nogo-A表达明显少于B组,差异有统计学意义(P＜0.05),且D组Nogo-A表达明显少于C组,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论1.大鼠慢性脑缺血3个月后,IGF-1表达无明显变化,Nogo-A表达明显增多。2.丁基苯酞高剂量和低剂量组均可使慢性脑缺血大鼠颞叶皮层和海马区IGF-1表达增加,Nogo-A表达减少,高剂量组作用更加明显。
|