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黑暗链霉菌基因转移系统的研究

作　者: 吴胜
导　师: 夏焕章
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 黑暗链霉菌 原生质体制备和再生 PEG－介导的原生质体 转化 接合转移 电转化
分类号: R915
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
下　载: 138次
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内容摘要


本论文研究了安普霉素、妥布霉素和卡那霉素B的产生菌黑暗链霉菌的基因转移系统，探索了通过PEG-介导的原生质体转化、接合转移、电转化等方法向黑暗链霉菌中转入外源DNA的可能性。首先考察了影响黑暗链霉菌9904原生质体形成的因素，发现在R2YE、YEME、GPYP、R3、SGGP、CP等几种不同的培养基中，通过CP培养基培养收获的菌体形成原生质体的效率最高。菌丝培养采用二级变温培养，即用CP培养基37℃培养48h，10％转种到补加2mg/ml甘氨酸的CP培养集中，28℃继续培养20h。溶菌酶作用浓度为2mg/ml，37℃保温1～1.5h。在此条件下，原生质体制备量为4.6×109/ml。原生质体再生采用R2YE培养基，其中蔗糖浓度为0.2mol/L，MgCl2·6H2O的浓度为20mmol/L。28℃培养5d，再生率约18％。多次尝试用pIJ702、pIJ4083、pCS5、pKC1140、pHZ132等各种质粒转化黑暗链霉菌9904原生质体，均未成功。检测了黑暗链霉菌胞外DNase的活性，发现定位于细胞膜的DNase对外源DNA有很强的降解作用。对原生质体进行“热处理”后转化、利用单链DNA转化等都不能将质粒导入黑暗链霉菌中，表明黑暗链霉菌对外源DNA有很强的限制作用。 接合转移和电转化可以克服某些链霉菌的限制修饰系统。将具有oriT的大肠杆菌——链霉菌穿梭质粒pHZ132转入大肠杆菌ET12567（pUZ8002）中，获得供体菌ET12567（pUZ8002，pHZ132）。将供体菌与预萌发的黑暗链霉菌9904的孢子悬液进行混合培养，成功地将pHZ132转入黑暗链霉菌9904中。考察了影响电转化效率的因素，在优化的条件下，通过电击质粒pHZ132和经溶菌酶处理的9904菌丝体混合物，质粒可低频转入菌株中。质粒pHZ132经黑暗链霉菌 界暗汪霉官幕因转谷正坑的研免 中文幻婴 自身修饰后也可转入 9904菌株的原生质体中，转化率为 10’一 10‘转 化子／微克pHZ132。黑暗链霉菌基因转移系统的建立为克隆其抗生素 生物合成基因和通过基因工程改造菌株奠定了基础。

全文目录


中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-22
材料和方法  22-35
  1 材料  22-29
    1．1 菌种与质粒  22-23
    1．2 培养基  23-25
    1．3 试剂  25-26
    1．4 缓冲液  26-28
    1．5 仪器  28-29
  2 方法  29-35
    2．1 大肠杆菌质粒DNA小量提取  29
    2．2 大肠杆菌质粒DNA大量提取  29
    2．3 链霉菌质粒DNA的提取  29-30
    2．4 链霉菌总DNA的提取  30
    2．5 大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备和DNA转化  30-31
    2．6 黑暗链霉菌原生质体的制备、再生及质粒DNA转化  31-32
    2．7 DNA酶切和连接  32
    2．8 DNA电泳和片段回收  32-33
    2．9 双链质粒DNA变性处理制备单链DNA  33
    2．10 黑暗链霉菌发酵及产物检测操作的实验方法  33-34
    2．11 接合转移实验  34
    2．12 电转化实验  34-35
实验结果  35-56
  第一部分 黑暗链霉菌原生质体的制备和再生  35-42
    1 菌丝培养基对黑暗链霉菌9904原生质体形成的影响  35-36
    2 菌丝培养条件的选择  36-38
      2．1 不同培养温度对原生质体形成和再生的影响  36-37
      2．2 甘氨酸浓度对菌丝体生长、原生质体形成及再生的影响  37-38
    3 酶解系统适宜条件的选择  38-40
      3．1 溶菌酶浓度对黑暗链霉菌9904原生质体形成和再生的影响  38
      3．2 酶解温度对原生质体形成和再生的影响  38-39
      3．3 酶解时间对原生质体形成和再生的影响  39-40
    4 再生条件的选择  40-41
    5 小结  41-42
  第二部分 黑暗链霉菌基因转移系统的建立  42-56
    1 抗性标记的选择  42
    2 PEG-介导的质粒DNA转化黑暗链霉菌原生质体  42-49
      2．1 质粒DNA直接转化黑暗链霉菌9904原生质体  42-43
      2．2 影响质粒转化因素的考察  43-45
        2．2．1 原生质体和质粒DNA浓度  43
        2．2．2 PEG浓度及分子量  43-44
        2．2．3 缓冲液  44
        2．2．4 菌丝培养时间  44
        2．2．5 硫链丝菌素选择时间  44-45
      2．3 内源性质粒  45
      2．4 DNase灭活及质粒DNA的转化  45-48
      2．5 限制—修饰系统  48-49
    3 接合转移系统  49-53
      3．1 利用接合转移成功地将质粒pHZ132转入黑暗链霉菌9904中  49-53
      3．2 用经黑暗链霉菌自身修饰的质粒可以转化9904菌株的原生质体  53
    4 电转化  53-56
结论  56-57
讨论  57-62
参考文献  62-70
致谢  70-71
附录  71

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物生物学
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