学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

嗜热乙醇杆菌遗传转化技术的研究

作　者: 王靖凯
导　师: 邵蔚蓝
学　校: 南京师范大学
专　业: 生物技术
关键词: 嗜热乙醇杆菌 定向进化 热稳定性DNA连接酶 电转化 超声转化 蛋白质表达纯化 电泳迁移率变动分析
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 17次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)作为嗜热菌中乙醇产量较高的菌种,它具有生长温度高,较好的耐酸性等优点以及完整的纤维素和半纤维素代谢系统,这些优点使其成为乙醇生产菌改造的热点。转录系统因低背景干扰,反应成分明确,结果清晰准确成为研究菌体转录情况的有力工具。嗜热乙醇杆菌的遗传转化体系建立包括：①寻找能够稳定存在于嗜热厌氧乙醇杆菌内的革兰氏阳性菌来源的复制子和构建整合质粒pTE-I2;②探索嗜热乙醇杆菌的电转化方法和超声转化方法,并且尝试通过转化的方法观察嗜热乙醇杆菌乙醇产量的变化。用pHsh和热稳定性DNA连接酶构建的定向进化系统,寻找能够稳定存在于嗜热乙醇杆菌的革兰氏阳性菌来源的复制子。以质粒为模板,含有抗性基因的线性片段作为引物,热稳定性Tma DNA连接酶与Taq DNA聚合酶同时加入到PCR反应体系中进行反应。利用Taq DNA聚合酶在扩增过程中引入错配碱基,Tma DNA连接酶将扩增产物中的Nick进行连接,扩增出的目标PCR产物为环状的质粒,该PCR产物直接转化嗜热乙醇杆菌感受态细胞,并在与引物所带的选择标记相应的抗性培养基中,选择性地培养含突变基因的转化子。Teth11作为一个背景完全未知的蛋白,通过本实验室之前的实验已经证实,Teth11能特异性结合在adhE基因上游启动子区域,此蛋白在体外转录系统中扮演阻遏蛋白的角色抑制基因表达。我们采取生物信息学预测蛋白结构,对其结构进行研究,发现该蛋白一级结构上具有两个保守区域,一个是位于一个区域位于N端第8个氨基酸和第11个氨基酸之间,保守序列为CPVC,另外一个保守区域在第68个氨基酸和第72个氨基酸之间,保守序列为SYPT。三级结构具有螺旋-转角-螺旋的DNA结合模体。第二段保守序列处于螺旋转角螺旋结构中,所以我们就对这个保守区域进行突变,通过观察体外和adhE基因上游启动子区域的结合情况来验证保守区域对蛋白功能的作用。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-9
第一章 绪论  9-15
  1.1 自然界中存在的乙醇代谢途径  9-10
  1.2 嗜热乙醇杆菌作为燃料乙醇生产菌株的优势  10-13
    1.2.1 燃料乙醇生产菌的要求  10-11
    1.2.2 目前燃料乙醇的生产工程菌简介  11-12
    1.2.3 嗜热乙醇杆菌的简介  12-13
  1.3 嗜热乙醇杆菌中乙醇代谢途径的研究现状  13-15
第二章 用于嗜热乙醇杆菌转化质粒的构建  15-32
  2.1 材料与方法  15-25
    2.1.1 菌株与质粒  15
    2.1.2 培养基与溶液  15
    2.1.3 主要试剂  15-16
    2.1.4 主要仪器设备  16
    2.1.5 基因操作  16
    2.1.6 DNA引物合成和DNA测序服务  16
    2.1.7 大肠杆菌质粒pTE-24的构建  16-17
    2.1.8 嗜热厌氧乙醇杆菌整合质粒pTE-I_2的构建  17-21
    2.1.9 嗜热厌氧乙醇杆菌质粒pTE-Ori的构建  21-23
    2.1.10 嗜热厌氧乙醇杆菌质粒pTE-adhE的构建  23-25
  2.2 结果  25-30
    2.2.1 大肠杆菌质粒pTE-24的构建  25-26
    2.2.2 T.ethanolicus JW200基因组的提取  26-27
    2.2.3 质粒pTE-I_2-down的构建  27-28
    2.2.4 嗜热厌氧乙醇杆菌JJW200整合质粒pTE-I_2的构建  28
    2.2.5 嗜热厌氧乙醇杆菌质粒pTE-Ori的构建  28-29
    2.2.6 嗜热厌氧乙醇杆菌质粒pTE-adhE的构建  29-30
  2.3 讨论  30-32
第三章 用大引物突变法对革兰氏阳性菌来源的复制子进行定向进化  32-43
  3.1 材料与方法  32-37
    3.1.1 菌种和质粒  33
    3.1.2 培养基与溶液  33-34
    3.1.3 主要试剂以及来源  34
    3.1.4 主要仪器设备以及来源  34
    3.1.5 大引物的制备方法  34-35
    3.1.6 极耐热性Tma DNA连接酶的生产和纯化  35-36
    3.1.7 由质粒pTE-24和热稳定性DNA连接酶组成的易错PCR  36-37
    3.1.8 转化子和转化子分析  37
  3.2 结果  37-41
    3.2.1 进行大引物随机突变所需的大引物的制备  37-38
    3.2.2 由质粒pTE-24和极耐热性Tma DNA连接酶组成的大引物随机突变  38-39
    3.2.3 由质粒pTE-24和热稳定性DNA连接酶组成的易错PCR结果  39-41
  3.3 讨论  41-43
第四章 嗜热厌氧乙醇杆菌的转化  43-58
  4.1 材料与方法  45-52
    4.1.1 菌株与质粒  45
    4.1.2 培养基与培养技术  45-49
    4.1.3 主要仪器设备  49
    4.1.4 嗜热厌氧乙醇杆菌的电转化  49-51
    4.1.5 转化子的验证与确定  51
    4.1.6 嗜热厌氧乙醇杆菌JW200的超声转化  51-52
    4.1.7 经过超声转化后的嗜热厌氧乙醇杆菌的乙醇产量的检测  52
  4.2 结果  52-55
    4.2.1 嗜热厌氧乙醇杆菌的电转化  52-54
    4.2.2 嗜热厌氧乙醇杆菌的超声转化  54-55
  4.3 讨论  55-58
第五章 来源于嗜热厌氧乙醇杆菌JW200的未知DNA结合蛋白TETH11的初步研究  58-69
  5.1 材料  58-59
    5.1.1 菌种与质粒  58
    5.1.2 培养基与溶液  58
    5.1.3 主要试剂及来源  58-59
    5.1.4 主要仪器及来源  59
    5.1.5 DNA引物合成和DNA测序服务  59
  5.2 方法  59-63
    5.2.1 Teth11基因的测序  59-60
    5.2.2 同源性和保守性分析  60
    5.2.3 Teth11的保守序列的突变  60-61
    5.2.4 突变后蛋白的表达  61
    5.2.5 突变后蛋白的纯化  61-62
    5.2.6 Bradford法测定蛋白浓度  62
    5.2.7 电泳迁移率变动实验  62-63
  5.3 结果与分析  63-67
    5.3.1 Teth11的测序  63-65
    5.3.2 Teth11的保守序列的突变  65
    5.3.3 突变后蛋白的纯化  65-66
    5.3.4 保守位点突变对蛋白与DNA结合的影响  66-67
    5.3.5 Teth11在转录中的作用  67
  5.4 讨论  67-69
第六章 全文总结  69-70
论文后记  70-71
参考文献  71-77
在读期间发表的学术论文及研究成果  77

相似论文

  1. 易错PCR定向进化扩展青霉FS1884脂肪酶,Q78
  2. 海藻糖改善枯草芽孢杆菌电转化方法的研究,Q78
  3. 热纤梭菌的纤维小体酶活性及遗传改造研究,Q936
  4. 人IFN-β在毕赤酵母中的表达及引入VHB提高人IFN-β产量,Q78
  5. 乳酸菌质粒提取方法及电转化条件的研究,Q78
  6. 烟草野火病菌EZ::Tn5突变体的构建、筛选和突变基因的克隆,S435.72
  7. 纺锤体相关蛋白spindlin1与甲基化组蛋白复合物的结构研究,Q51
  8. 蛋白质内含子体内定向进化和切割、分段表达及体外剪接,Q51
  9. α—乙酰乳酸脱羧酶的定向进化及低温条件下高活力突变酶的筛选,Q55
  10. 面向靛玉红生物制备的细胞色素P450 BM-3半理性定向进化,Q559.9
  11. 蛋白质工程和溶剂工程改变嗜热酯酶的底物特异性和活性,Q55
  12. 南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母细胞表面高效展示体系的构建与定向进化研究,Q78
  13. 超氧化物岐化酶的定向进化,Q55
  14. 巴西固氮螺菌Yu62在玉米根部的定殖固氮芽孢杆菌的分离及其glnB基因的研究,S154.3381
  15. 嗜水气单胞菌聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成调控的初步研究,R914
  16. 少根根霉脂肪酶基因的表达及定向进化研究,Q78
  17. 煤电转化材料过程工程研究,TM611
  18. HRP基因的表达、进化及其催化苯胺类化合物聚合反应的研究,O631.3
  19. BMP拮抗剂对远端肢芽骨骼发育影响的研究及中国汉族人群精神分裂症的关联分析,R681
  20. 脱毛蛋白酶产生菌的选育及其碱性蛋白酶基因的克隆与表达,Q93

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com